玉米秸秆纤维素降解菌的紫外-微波复合诱变及产酶条件优化

魏 炜,赵之璧,袁雅姝

(沈阳建筑大学市政与环境工程学院,辽宁 沈阳 110168)

玉米秸秆在农业副产物中占比较大[1-2],简单焚烧会造成大气污染和资源浪费,纤维素是玉米秸秆细胞壁的主要成分,结构较为复杂,质地结实紧密[3],传统的物理和化学方法对秸秆降解的效率不高,而生物法降解可以弥补上述不足[4-5]。高云航等[6]从牛粪中筛选出一株纤维素酶活性较高的菌株N12。高兆明等[7]从厦门红树林泥样中筛选到一株纤维素酶产生菌G21。李君君[8]针对茶粕进行研究,从土壤、树叶和腐烂的树叶中筛选出了L-1、L-2、L-3、L-4、L-5和L-6纤维素降解菌株。鲁雄[9]以甘蔗渣为唯一碳源,从厦门温泉样品中筛选出热稳定纤维素产生菌XM70。王岩等[10-11]以农村自然堆肥堆秸秆还田土为菌源,在15 ℃低温的培养条件下成功筛选出单菌54株。景如贤等[12]采取克氏碘液染色法从常年落叶的土壤中分离出高效降解菌。纤维素分解菌的筛选与鉴定是决定能否实现秸秆高效转化为葡萄糖的关键。因此,笔者以沈阳地区的土样为原料,利用刚果红染色法从中筛选出降解性能相对较好的两种菌株并进行鉴定,通过紫外-微波复合诱变筛选出降解性能更好的菌株,并对产酶条件进行了优化,为提升降解秸秆菌的性能提供了理论依据。

1.1 秸秆及土样

实验秸秆采自沈阳市张官桥下河畔处的玉米田,大多数秸秆已经腐烂,并被降解风干成碎屑状。实验土样采自沈阳建筑大学景观稻田、古树下,张官桥下玉米田、菜地,以及天柱山下等自然环境土壤。

1.2 主要试剂、培养基及仪器设备

试剂:浓度为0.05 mol/L,pH为4.8的醋酸缓冲液;CMC-HAc缓冲液;DNS试剂[13];质量浓度为1 g/L的葡萄糖标准液。

培养基:富集培养液[14];羧甲基纤维素钠分离筛选培养基;刚果红纤维素琼脂培养基[15];滤纸条液体培养基[16];羧甲基纤维素钠培养基。

仪器设备:烘箱;恒温震荡培养箱;鼓风干燥箱;高速多功能粉碎机;高压蒸汽灭菌锅;冰箱;高速离心机;电磁炉;生物显微镜等。

1.3 实验方法

菌株形态学鉴定采用革兰氏染色法[17]并参考菌株鉴定手册;菌株分子学鉴定采用细菌16SrDNA序列测序的方法。

采用Van Soest分析法测定纤维素降解率。

羧甲基纤维素(CMC)酶活力和滤纸(FPA)酶活力的测定依据下式:

(1)

式中:A为CMC或FPA酶活力,U/mL;C为还原糖质量浓度,g/L;X为稀释倍数,取25;V为总酶液体积,取10 mL;T为作用时间,取30 min;V1为参与反应的酶液体积,取0.5 mL;M为葡萄糖分子量,180。

2.1 菌株的筛选及鉴定

2.1.1 菌株的初筛

表1为7株纤维素降解菌透明圈直径D、菌落直径d及其比值。

表1 7株纤维素降解菌透明圈及菌落直径Table 1 Clear circle and colony diameter of 7 cellulose degrading bacteria

选取D/d值相对较大的菌株Ⅰ、菌株Ⅳ、菌株Ⅴ和菌株Ⅵ4种菌株进行滤纸条断裂实验。培养15 d的断裂情况如表2所示,其中菌株Ⅰ在第6 d开始断裂;菌株Ⅳ和菌株Ⅴ虽然在前9 d断裂程度一样,但菌株Ⅳ在12 d断裂程度更深,菌株Ⅴ在12 d没有变化。可见,菌株Ⅰ、菌株Ⅳ降解性相对较好。

表2 4株降解菌的滤纸条断裂情况Table 2 Break of filter paper of 4 strains of degrading bacteria

选取滤纸条断裂情况较好的菌株Ⅰ、菌株Ⅳ进行刚果红液体验证实验,5 d后观察发现:菌株Ⅰ液体底部有大量红色沉淀,液体颜色变透明;菌株Ⅳ液体底部有少量红色沉淀,液体颜色变浅,仍有少量颜色。可见,菌株Ⅰ对纤维素的降解性最好、菌株Ⅳ次之。

2.1.2 菌株Ⅰ的复筛

初筛并不足以说明降解性能的优劣,还需要测定酶活力和降解率加以验证,测得的葡萄糖标准曲线如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

实验分别测出菌株Ⅰ、菌株Ⅳ、菌株Ⅴ的CMC酶活力、FPA酶活力、吸光度及产糖量,将测定的吸光度值代入葡萄糖标准曲线中求出还原糖含量,用酶活力公式求出酶活力值,测得的纤维素降解率如表3所示,可以看出,菌株Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ的CMC酶活力分别是1.050 U·mL-1、0.917 U·mL-1、0.858 U·mL-1;FPA酶活力分别为0.942 U·mL-1、0.810 U·mL-1、0.800 U·mL-1;纤维素降解率分别为22.09%、15.73%、14.23%。由此可见,无论是CMC和FPA酶活力,还是降解率,菌株Ⅰ都是最优的,与初筛的实验结果一致。

表3 CMC和FPA酶活力及降解率测定结果Table 3 Results of CMC and FPA enzyme activity and degradation rate determination

2.1.3 菌株Ⅰ的16SrDNA分子学鉴定

对菌株Ⅰ进行基因组DNA提取、16S扩增、PCR产物的检测,然后进行纯化、测序,最后进行Ncbi-Blast比对分析,完成16S rDNA基因分子鉴定。图2为对纤维素降解性能最好的菌株Ⅰ的16S rDNA同源性系统发育树。根据Blast分析结果,菌株Ⅰ与Streptomyces sp.FZ92亲缘关系最近,达到99.93%;菌株Ⅳ与Streptomyces rubiginosus亲缘关系最近,达到99.65%,由此初步判定菌株Ⅰ为链霉菌。

图2 菌株Ⅰ的16S rDNA同源性的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S rDNA homology of strain I

2.2 菌株Ⅰ的紫外诱变育种

2.2.1 菌株Ⅰ的紫外诱变及初筛结果

制备孢子浓度为 1.0×108个/mL的菌悬液,置于紫外灯下进行常规处理,设定照射时间分别为20 s,40 s,60 s,100 s,120 s;在不同照射时间取样,在涂布过程中避免被光照射,置于40 ℃培养箱,暗培养24 h,再见光培养48 h。紫外照射产生的影响如图3所示。

图3 紫外诱变的影响Fig.3 The influence of ultraviolet mutagenesis

从图3可以看出,孢子的致死率随着紫外线照射时间的延长而增加,当照射时间增至60 s、80 s、120 s时,致死率分别为78%、85%和98%,选择80s为最佳照射时间进行筛选。选取D1/d1较大的6株菌种,分别命名为SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6,进行固态发酵复筛实验。

2.2.2 菌株Ⅰ的紫外诱变复筛结果

表4为紫外诱变后的复筛结果。可以看出,菌株经过紫外诱变后,不论是CMC和FPA酶活力,还是对纤维素的降解效率,都有所提升,尤其是菌株SF3对纤维素的降解率达到29.37%,与未诱变相比提升了7.28%,因此选用菌株SF3进行复合诱变实验。

表4 菌株Ⅰ的微紫外诱变复筛结果Table 4 Rescreening results of strain I by UV mutagenesis

2.3 菌株SF3的紫外-微波复合诱变育种

菌株SF3的复合诱变时间对孢子的影响如图4所示。根据图4结果,选择1 min作为微波诱变时间进行复合诱变。

图4 复合诱变时间对孢子的影响Fig.4 Effect of compound mutagenesis time on spores

经紫外-微波复合诱变后的复筛结果如表5所示。从表5中可以看出,菌株经过复合诱变后,不论是对CMC和FPA酶活力,还是对纤维素降解效率的影响,与单独紫外诱变和未诱变相比都有了极大的提升,尤其是菌株SF3-3对纤维素的降解率达到40.21%,与未诱变相比提升了18.12%,与单独紫外诱变相比提升了10.84%,且通过重复固态发酵,其稳定性较好,对纤维素的降解率始终保持在30.57%～40.21%。由此可见,紫外-微波复合诱变与传统的单独诱变相比效果更好。SF3-3可作为复合诱变产生的新菌株进行产酶条件优化。

表5 紫外-微波复合诱变菌株的复筛结果Table 5 Results of re-screening of UV-microwave combination mutagenic strains

2.4 产酶条件优化

2.4.1 不同温度对酶活力的影响

温度直接影响到菌株的生理活性。一般真菌的最佳发酵温度在25 ℃左右,细菌在30 ℃左右。因此,设定实验温度分别为20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃。将菌株接种于pH为7.0的50 mL培养基中,分别在以上温度条件下130 r/min振荡培养4 d,制备粗酶液,测定CMC及FPA活力,结果如图5所示。

图5 温度对CMC和FPA酶活力的影响Fig.5 Effect of temperature on CMC and FPA enzume activity

由图5可知,温度对CMC和FPA酶活力影响较大,在其他条件相同时,CMC和FPA酶活力均呈先升高后降低的趋势。当温度达到28 ℃,CMC和FPA酶活力均达到最大值,分别为1.996 U/mL和1.951 U/mL,在此温度下,菌株的酶促反应速率达到较高,产酶条件达到最佳。在低于25 ℃和高于30 ℃时,由于温度较为极端导致菌株部分酶失活变性,在一定程度上抑制了CMC和FPA的酶活力,尤其是在20 ℃时CMC和FPA酶活力均达到最低值,分别为1.184 U/mL和1.126 U/mL。因此可将后续实验的温度设置为28 ℃。

2.4.2 不同培养基初始pH值对酶活力的影响

培养基初始pH值改变产酶效果的机理是由于pH可以改变菌株细胞内部的电荷量,在一定程度上影响了酶的构造及酶促反应的速率。设定发酵培养基初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,将培养过夜的菌种分别接种于50 mL培养基中,再分别在28 ℃条件下,130 r/min振荡培养4 d后制备粗酶液,测定CMC及FPA酶活力,图6为测定结果。

图6 pH对CMC和FPA酶活力的影响Fig.6 Effect ofpH on CMC and FPA enzume activity

由图6可知,培养基初始pH值对CMC和FPA的酶活力的影响较大,从图中可以看出,在其他条件都相同的情况下,CMC和FPA酶活力呈现先升高再降低的趋势,且不同pH下的酶活力差异也比较显著,因此表明培养基初始pH对菌株的CMC和FPA酶活力影响较大。当pH值呈酸性时,酸性越强酶活力越低,当pH为4.0时,CMC和FPA酶活力达到酸性条件下也是整体条件下的最低值,分别为1.260 U/mL和1.126 U/mL;当pH升高至中性时,酶活力有了明显的提高,其中当培养基初始pH值达到7.0时,CMC和FPA酶活力达到最大分别为2.072 U/mL和1.871 U/mL;继续升高pH达到碱性时,酶活力逐渐降低,直到pH达到9.0时,CMC和FPA酶活力达到碱性条件下的最低值,分别为1.753 U/mL和1.646 U/mL。由此可见,酸性条件下对菌株酶活力的影响程度要强于碱性。最适培养基初始pH值为7.0。

2.4.3 不同接种量对酶活力的影响

将菌株分别按1%、2%、4%、6%、8%、10%的接种量接种于50 mL、初始pH值为7.0的培养基中,在28 ℃、130 r/min的条件下振荡培养4 d后取发酵液,测定CMC及FPA活力,以确定最佳接种量(见图7)。

图7 接种量对CMC和FPA酶活力的影响Fig.7 Effect of inoculation amount on CMC and FPA enzume activity

从图7中可知,接种量对酶活力的影响不是很大,随接种量呈先升高再下降的趋势,在其他条件相同时,该菌的接种量为2%时,其CMC和FPA酶活力均达到最大值,分别为1.603 U/mL和1.523 U/mL,当接种量超过2%时,菌株的酶活力逐渐降低,尤其是当接种量达到10%时,其CMC和FPA酶活力均达到最低值,分别为1.501 U/mL和1.465 U/mL,接种量的增加导致酶促反应无法正常进行,在一定程度上抑制了产酶效果,因此最适接种量为2%。

2.4.4 不同转速对酶活力的影响

将菌株以接种量为2%接种到初始pH值为7.0发酵培养基中,分别设定摇床转速为100 r/min、130 r/min、148 r/min、180 r/min,均置于28 ℃条件下振荡培养4 d后取发酵液,测定CMC及FPA活力,图8为实验结果。

图8 转速对CMC和FPA酶活力的影响Fig.8 Effectof rotational speed on CMC and FPA enzume activity

由图8可知,转速对CMC和FPA酶活力的影响不是很大,在其他条件相同时,该菌的最适转速为130 r/min,其CMC和FPA酶活力均达到最大值,分别为1.642 U/mL和1.563 U/mL,当转速低于100 r/min和高于180 r/min时,在一定程度上抑制了产酶效果,且在转速达到180 r/min时,CMC和FPA酶活力均达到最小值,分别为1.599 U/mL和1.489 U/mL,造成酶活力较低的原因是过快的转速可能改变菌株细胞变性或使之失活,在一定程度上影响了酶促反应速率,因此,该菌株的最适宜转速为130 r/min。

2.5 正交试验及验证

由于诱变后的Streptomyces sp.FZ92C的CMC和FPA酶活会受到多种因素的影响,因此要确定一个最佳的反应条件。将培养时间设置为4d,设计了正交试验,各因素水平表如表6所示。

表6 正交试验因素水平表Table 6 Factor level table of orthogonal test

正交试验极差越大,说明影响就越大。正交试验结果如表7所示,从表7中4种单因素CMC与FPA正交试验的极值实验结果可以看出,对两种酶活力影响最大的是温度,其次是培养基pH值,再次是接种量,最后是转速。

表7 正交试验结果表Table 7 Results of orthogonal test

通过正交试验得出的结果确定最佳条件:温度为28 ℃、接种量为2%、pH值为6.0、转速为130 r/min,此时的CMC酶活力为1.812 U/mL,FPA酶活力为1.812 U/mL。单因素试验得出的最佳试验条件:温度为28℃、接种量为2%、pH值为7.0、转速为130 r/min,CMC酶活力为2.072 U/mL,FPA酶活力为1.464 U/mL。由此可见单因素试验得出最佳条件时的CMC和FPA酶活力要高于正交试验最佳条件时的CMC和FPA酶活力,因此最佳产酶条件:温度为28℃、接种量为2%、pH值为7.0、转速为130 r/min。

(1)从张官桥下玉米地筛选出来的两株降解菌经16S rDNA鉴定均为链霉菌属菌种,菌株Ⅰ与Streptomyces sp.FZ92亲缘关系为99.93%;菌株Ⅳ与Streptomyces rubiginosus亲缘关系99.65%,且菌株Ⅰ的降解性能最好,达12.08%。

(2)对菌株Ⅰ进行紫外-微波复合诱变,得到1株纤维素降解性能最好、对秸秆降解效率达到40.21%的菌株SF3-3,与未诱变株相比降解率提升了18.12%,与单独紫外诱变株相比降解率提升了10.84%,复合诱变极大地提高了菌株的降解性能。

(3)两种酶活力的影响因素强弱依次为:温度、培养基初始pH值、接种量、转速;复合诱变后的菌株SF3-3的最佳产酶条件:温度为28 ℃、接种量为2%、pH值为7.0、转速为130 r/min。

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