基于AMPK通路探究电针结合有氧运动对肥胖大鼠的作用机制

周 骞,向丽婷,史赛君,田梦影,龙 专,宋 洋

(1.湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007;2.湖南体育职业学院,湖南 长沙 410000;3.湖南中医药大学,湖南 长沙 410000)

随着社会经济的快速发展,人们生活水平的提高,肥胖已成为重要的社会公共卫生问题,全球近1/3的人口已被确定为肥胖或超重[1]。肥胖作为一种常见的临床综合征,在遗传和环境因素的共同作用下,人体脂肪含量过高及异常分布,可引发心血管疾病和各种内分泌代谢紊乱[2]。肥胖的治疗包括饮食干预、生活方式干预、药物治疗和手术等,药物和手术治疗因技术问题以及产生的不良反应,难以在临床应用和推广[3-4]。而运动疗法作为一种治疗肥胖安全有效的方法,一直是医学、体育学等领域的研究热点。大量研究表明,多数有氧运动可以达到消耗能量的目的,是促进机体健康的有效手段。针灸疗法具有疏通经络、调节阴阳、扶正祛邪之功效,在治疗肥胖方面取得了显著的临床效果,且应用方便、经济安全[5]。腺苷酸活化蛋白激酶(adenine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是调节组织能量代谢的主要靶点,由肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)激活,在脂质代谢中发挥关键作用[6-7]。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)是AMPK的下游靶点,在脂肪酸合成过程中有着重要作用。研究[8]发现,激活LKB1/AMPK通路有明显的降脂作用。因此,本研究建立了高脂饮食肥胖大鼠模型,通过检测AMPK/ACC通路相关指标来探究电针结合有氧运动调节肥胖大鼠的可能机制,为临床治疗提供参考。

1.1 仪器 Infinite M100全波长多功能酶标仪:瑞士Tecan公司;Vibra Cell型超声波破碎仪、电子分析天平(0.1 mg,120 g)、Fresco21高速低温离心机、涡旋混合器、TS-1脱色摇床、DM1000 LED生物显微镜:德国徕卡生物科技公司;WB凝胶成像系统:BIO-RAD公司;石蜡包埋机、切片机:湖北泉林医疗设备有限公司;37 ℃恒温箱:上海精宏公司。

1.2 试剂 总胆固醇(total cholesterol,TC)试剂盒(批号 CB11076-Ra)、三酰甘油(triglyceride,TG)试剂盒(批号 CB10370-Ra)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)试剂盒(批号 CB10309-Ra)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)试剂盒(批号 CB10309-Ra)、大鼠白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)试剂盒(批号 CB10218-Ra)、大鼠白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)试剂盒(批号 CB10218-Ra)、大鼠三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)试剂盒(批号 CB10218-Ra)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号 PC0020):北京索莱宝科技有限公司;SDS-PAGE上样缓冲液、凝胶制备试剂盒(货号 CW0027S):江苏康为世纪科技有限公司;p-LKB1、p-AMPK、LKB1、AMPK、ACC、GADPH抗体(批号分别为ab63473、ab92701、ab15095、ab32047、ab109368、ab8245):Abcam公司。

1.3 动物 SPF级雄性SD健康大鼠45只,200～220 g,由湖南中医药大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(湘)2022-0005。所开展的动物实验均遵守“3R”原则及国际实验动物伦理学要求,实验过程中对动物的各种处理均遵照《关于善待动物的指导性意见》的有关规定。SD大鼠饲养于实验动物房,饲养温度为20～24 ℃,湿度为(55±10)%,保持12 h照明/12 h黑暗。

2.1 模型复制及分组 从45只SD大鼠中随机挑选8只作为空白组,其余37只大鼠用高脂饲料(45%脂肪、35%碳水化合物、20%蛋白质)喂养8周建立肥胖模型,将采用高脂饲料喂养的大鼠体质量高于空白组大鼠体质量的30%作为模型复制成功的标准。剔除模型复制失败的5只大鼠,其余32只随机分配到模型组(高脂饲料)、电针组(高脂饲料联合穴位电针)、运动组(高脂饲料联合运动)、电针联合运动组(高脂饲料联合穴位电针及运动),每组8只。

2.2 干预方法 电针组:参考文献[9]定位大鼠“关元”“天枢”“丰隆”“足三里”穴,将大鼠固定于固定架后,用一次性无菌针直刺在腹部(“关元”“天枢”定位在大鼠脐下25 mm处)和下肢部(“足三里”“丰隆”定位在大鼠膝关节外)穴位,深度为4 mm,连接电针仪,频率为2/100 Hz,脉冲宽度为0.5 ms,行针以大鼠出现轻微颤抖为宜,留针30 min,治疗5 d休息2 d,共干预8周。运动组:大鼠每日进行45 min的无负重游泳运动,水温为30～32 ℃,水深55 cm左右,每周5 d,共8周,运动前1周应进行适应性训练,且游泳时应时刻观察大鼠动态,以防大鼠溺水死亡[10]。电针联合运动组:电针方法同电针组,大鼠每日上午进行电针后6 h,再进行45 min无负重游泳训练。模型组:将大鼠固定后不予处理。空白组:正常饮水、饮食,不予任何干预。

2.3 大鼠体质量 每周固定时间记录每只大鼠的体质量,评估不同干预方法对大鼠身体状况的影响。

2.4 ELISA法检测大鼠血脂、炎症因子、ATP水平 干预8周后,腹主动脉取血5 mL,分离血清,4 ℃离心(3 500 r/min,15 min)。取上清液并于-80 ℃冰箱保存。使用大鼠ELISA试剂盒检测大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C,炎症因子IL-1β、IL-6和能量指标ATP水平。

2.5 苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察大鼠肝组织脂肪形态 取大鼠肝组织,用4%中性多聚甲醛溶液固定,样本经脱水、包埋、切片、脱蜡、水洗后,采用HE染色、封片,光学显微镜下观察。

2.6 Western blot法检测大鼠肝组织p-LKB1、p-AMPK、ACC蛋白表达水平 精密称取大鼠肝组织,加入RIPA裂解液提取总蛋白,再用研磨仪于冰上匀浆,离心30 min后取上清。按照BCA蛋白定量法测定蛋白浓度,配制SDS-PAGR凝胶,每孔上样20 μg;80 V电泳,300 mA电转,5%脱脂牛奶中封闭摇床孵育90 min进行封闭;一抗孵育:根据目的蛋白分子量将印迹膜裁剪成一定宽度的条带,加入用5% BSA配制好的一抗[GAPDH(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、p-LKB1(1∶1 000)、LKB1(1∶1 000)、ACC(1∶2 000)]浴液,放置4 ℃冰箱孵育过夜;加入HRP标记的IgG二抗(1∶10 000),室温孵育1 h,取适量ECL-A液和ECL-B液等容积混合,配制成化学发光检测工作液进行显影。

3.1 5组大鼠体质量比较 与空白组比较,模型组大鼠体质量显著增加(P<0.05),表明高脂饮食可以显著增加大鼠体质量;与模型组比较,电针联合运动组大鼠体质量显著减少(P<0.05),表明电针联合运动能够显著抑制大鼠体质量增长。见图1。

注:与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.2 5组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较 与空白组比较,模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平显著升高(P<0.05),HDL-C水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,电针联合运动组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平显著降低(P<0.05),HDL-C水平显著升高(P<0.05)。见图2。

注:A.空白组;B.模型组;C.电针组;D.运动组;E.电针联合运动组;与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.3 5组大鼠血清炎症因子、ATP水平比较 与空白组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05),ATP水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,电针联合运动组大鼠血清IL-1β、IL-6水平显著降低(P<0.05),ATP水平显著升高(P<0.05)。见图3。

注:A.空白组;B.模型组;C.电针组;D.运动组;E.电针联合运动组;与空白组比较,∗P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.4 5组大鼠肝脏组织形态比较 空白组大鼠肝细胞内细胞核分布均匀,细胞大小均一,没有脂肪颗粒浸润,肝组织结构完整;模型组大鼠肝小叶结构紊乱,出现明显的脂肪空泡,肝细胞排列紊乱,细胞边界不清晰;相较于模型组,电针组、运动组大鼠肝细胞脂肪体积减少,但有部分的脂肪滴;电针联合运动组大鼠肝细胞内几乎看不到脂肪颗粒,且细胞排列整齐,边界清晰。见图4。

注:A.空白组;B.模型组;C.电针组;D.运动组;E.电针联合运动组

3.5 5组大鼠肝组织p-AMPK、p-LKB1、ACC蛋白表达水平比较 与空白组比较,模型组大鼠肝组织p-AMPK、p-LKB1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),ACC蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,电针联合运动组大鼠肝组织p-AMPK、p-LKB1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),ACC蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图5。

注:A.空白组;B.模型组;C.电针组;D.运动组;E.电针联合运动组;与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

肥胖是由于饮食不节、缺乏体力活动等多种原因导致的体内膏脂过多,使体质量高于一定范围,或伴有其他症状的一种疾病[11-13]。《素问·奇病论》曰:“此肥美之所发也,此人必数食甘美而多肥也。”《备急千金要方》也有“饱食即卧,乃生百病”的告诫,提示饮食失节是导致肥胖的关键[14-15]。因此,本研究采用高脂饲料喂养诱导肥胖大鼠模型,模拟因过度饮食和缺乏运动而引起的肥胖。结果表明,高脂饮食可以显著增加大鼠体质量(P<0.05),血清TG、TC、LDL-C水平显著升高(P<0.05),HDL-C水平显著减少(P<0.05),并伴有动物动作缓慢,毛发油腻,提示肥胖大鼠模型构建成功。

肥胖主要与脾胃功能失常引起的膏脂、水湿、痰饮聚集有关[16-18]。关元是人体培补元气的重要穴位,针刺关元既能培补脾胃后天之本,又能温补肾脏先天之本[19];天枢是足阳明胃经的腧穴,也是大肠募穴,能将人体清气运输到胃,把浊气转运到肠,促进食物消化;丰隆为足阳明经的络穴,是益气壮阳、健脾祛湿化痰的要穴[20];足三里为补虚强壮之要穴,可增强运动耐力,增强体内代谢[21-22]。本研究对肥胖大鼠“关元”“丰隆”“天枢”“足三里”进行电针干预,并结合有氧运动,实验结果表明,电针联合运动对肥胖大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平有显著改善作用(P<0.05),能达到健脾益气、减肥降脂的作用。肥胖通常被认为一种全身的慢性低度炎症状态,在白色脂肪细胞增生肥大时,会分泌促炎因子IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α等[23-24]。本研究结果显示,电针联合运动可显著降低大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β水平(P<0.05),提示电针联合运动对改善炎症具有较好的效果。

肝脏是机体调节糖脂代谢的重要器官之一。据报道[25-26],AMPK是细胞能量感受器,主要作用于糖代谢、脂代谢、线粒体生物合成和自噬等方面。在哺乳动物中,LKB1为级联反应中的重要上游激酶,p-LKB1可与AMPK-α亚基172位苏氨酸磷酸化位点结合,使AMPK活化,并通过ACC的磷酸化和失活,让机体开始分解代谢ATP,使之有效应对机体低能量状态和线粒体损伤[27]。不仅如此,AMPK可激活ACC,抑制胆固醇和脂肪合成。有研究[28]表明,激活AMPK可明显降低胰岛素抵抗大鼠TG、长链游离脂肪酸水平,提高HDL水平,降低腹型肥胖,由此推断激活AMPK可以纠正大鼠脂质代谢紊乱。

综上所述,电针联合运动组干预效果要优于其他单一疗法组,可以显著改善肥胖大鼠体质量、脂质水平,降低炎症因子水平,增加ATP含量,推测其机制可能与激活LKB1/AMPK通路有关。

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