健脾补肾化瘀胶囊对老年2型糖尿病大鼠神经保护相关蛋白的调控作用

李娟娟 南一 袁玲 党翔 宋丽 党毓起

(宁夏医科大学 1中医学院,宁夏 银川 750004;2药学院;3附属银川市中医院)

最近研究数据表明,我国约有糖尿病(DM)患者1.26亿,患病率约达11.2%〔1〕。DM认知功能障碍(DCD)是DM的中枢神经系统并发症,国内外研究结果显示DM是引起认知功能下降和痴呆的重要危险因素〔2～4〕,与其他非DM患者相比,DM患者患痴呆的风险显著增加〔5〕,且2型DM(T2DM)发生认知功能障碍的风险更大,DCD患者临床主要表现在近记忆力减退、注意力下降、执行能力及抽象思维下降、推理能力及运动协调能力下降〔6〕,随着病程延长,后期可发展为痴呆;患者还伴发有抑郁、情绪控制能力及心理适应能力下降等情绪障碍〔7〕。随着老年T2DM患者数量的增加,伴有认知功能障碍的DM患者越来越多。目前,T2DM的管理策略并不有利于认知功能障碍的改善,从而给患者、家庭和社会带来负担,DM在认知功能损伤和痴呆的发生发展过程中的作用已成为科研及临床关注的重点。研究发现,褪黑素(MT)、褪黑素受体(MTR)、环磷酶腺苷(cAMP)、脑源性神经养因子(BDNF)、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)在认知功能损害中具有重要作用,本实验旨在探讨健脾补肾化瘀胶囊对认知功能的影响。

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠100只,17月龄,购自宁夏医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK(宁)2020-0001。获得宁夏医科大学伦理委员会批准,饲养于宁夏医科大学实验动物中心独立通气笼中,2只/笼,室内温度与湿度恒定,每日给予大鼠充足的饲料与水,所有实验遵循实验动物伦理学规定。

1.2主要药物 健脾补肾化瘀胶囊(由宁夏医科大学附属银川市中医院提供,院内制剂编号:rhdm041-sjh01-04,药物组成:黄芪、党参、赤芍、当归、地龙、牛膝、生地黄、熟地黄、茯苓、红花、酒黄精、肉桂等)。奥拉西坦胶囊(规格:0.4 g ×24粒,批号:H20031033,石药集团欧意药业有限公司)。

1.3主要仪器及试剂 -80 ℃冰箱(美国,Thermo)电子秤(11387921,日本独资上海寺冈电子有限公司),离心机(TD5KR,中国东旺仪器 ),酶标仪(MultiSan3,美国Thermo),切片机(LEICA RM2235,徕卡公司),数字病理扫描系统(Aperio LV1,徕卡公司),链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司),酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海江莱生物科技有限公司),Anti-BDNF(北京博奥森生物科技有限公司),二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.4T2DM大鼠造模、分组及给药 100只SD雄性大鼠,饲养至18月龄后,可满足老年大鼠实验要求〔8,9〕,将大鼠随机分为两组,对照组(10只)给予普通饲料;其余为实验组,喂高脂高糖饲料(Boaigang-1135DM,由北京博爱港生物技术有限公司提供),均自由进食、饮水4 w,诱发胰岛素抵抗,将实验组大鼠空腹12 h后,按37 mg/kg体质量腹腔注射1% STZ溶液,注射后继续喂以高脂高糖饲料,对照组腹腔注射相当剂量的柠檬酸钠缓冲液,喂普通饲料,72 h后尾静脉点刺采血检测大鼠随机血糖,选择血糖≥16.7 mmol/L的大鼠,维持稳定2 w作为T2DM大鼠成模标准〔10〕。造模成功后,将实验组随机平均分为Model组、ORC组、JPBS组、JPBS+ORC组,每组10只,采用灌胃给药方式干预6 w,1次/d,ORC组给予奥拉西坦0.2 g/kg〔11〕,JPBS组给予健脾补肾化瘀胶囊0.6 g/kg〔12〕,JPBS+ORC组给予健脾补肾化瘀胶囊0.6 g/kg+奥拉西坦0.2 g/kg,对照组和 Model组给予等体积生理盐水,根据体质量调整给药剂量。对照组、ORC组、JPBS组、JPBS+ORC组给予普通饲料,Model组继续喂以高脂高糖饲料,给药期间观察大鼠一般情况变化。

1.5血清的采集和检测 Morris水迷宫实验结束后,大鼠禁食12 h麻醉后心尖取10 ml,分离血清,4 ℃ 3 000 r/min,离心15 min,收集血清样本,将血清分装到无菌EP管中,保存于-80 ℃冰箱用于ELISA试剂盒检测MT、MTR、cAMP。

1.6脑组织取材、标本制备及检测方法 待大鼠深度麻醉后,仰卧位固定,由剑突处剪开胸腔充分暴露心脏,输液器专用针头从左心室插入至升主动脉,固定针头,剪开右心耳,先用预热的0.9%氯化钠注射液快速灌注,直至从右心耳流出液体变清亮后,换用预冷的4%多聚甲醛溶液缓慢灌注至大鼠身体僵硬。充分固定后,冰浴取脑,分离含有海马的脑组织,置于4%多聚甲醛溶液中固定过夜。脱水,透明,浸蜡,切片,烤片。放入切片盒内,4 ℃冷藏保存。HE染色观察海马组织病理形态学改变,免疫组化法检测海马组织BDNF蛋白表达。

1.7统计学处理 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2.1健脾补肾化瘀胶囊对海马组织病理学观察 与对照组相比,Model组神经元排列松散、无序、模糊,细胞核和细胞质之间界限不清晰。给予健脾补肾化瘀胶囊治疗后,JPBS组和JPBS+ORC组海马神经细胞损伤得到有效缓解,坏死和凋亡细胞数量也明显减少,且神经细胞损伤逐渐减轻或维持稳定,特别是在JPBS+ORC组中最显著,与Model组相比,ORC组海马组织损伤情况也有所改善,见图1。

图1 各组海马组织(HE染色,×200)

2.2健脾补肾化瘀胶囊对T2DM大鼠MT、MTR表达的影响 Model组MT、MTR表达显著低于对照组(P<0.01),除ORC组MTR外,ORC组、JPBS组、JPBS+ORC组MT和MTR与Model组相比均显著升高(P<0.01);JPBS组和JPBS+ORC组MTR表达显著高于ORC组(P<0.01);JPBS组MT表达显著低于ORC组(P<0.01),JPBS+ORC组显著高于ORC组(P<0.05),见表1。

表1 各组MT、MTR、cAMP蛋白表达

2.3健脾补肾化瘀对T2DM大鼠cAMP表达的影响 Model组cAMP表达显著低于对照组(P<0.01),ORC组、JPBS组、JPBS+ORC组与Model组相比均显著升高(P<0.01),JPBS组和JPBS+ORC组显著高于ORC组(P<0.01),见表1。

2.4健脾补肾化瘀胶囊对T2DM大鼠BDNF表达的影响 Model组BDNF表达显著低于对照组(P<0.01),ORC组、JPBS组、JPBS+ORC组与Model组相比均显著升高(P<0.01),且JPBS+ORC组显著高于ORC组(P<0.01),JPBS组与ORC组相比无统计学差异(P>0.05),见表1、图2。

图2 健脾补肾化瘀胶囊对T2DM大鼠BDNF表达的影响(×200)

2.5健脾补肾化瘀胶囊对T2DM大鼠nNOS表达的影响 Model组nNOS表达显著低于对照组(P<0.01),ORC组、JPBS组、JPBS+ORC组与Model组相比均显著升高(P<0.01),JPBS组、JPBS+ORC组显著高于ORC组(P<0.01),见表1、图3。

图3 健脾补肾化瘀胶囊对T2DM大鼠nNOS表达的影响(×200)

研究发现〔13〕,T2DM患者或动物其血清MT水平均下降,尤其在夜间更加明显;且MT昼夜分泌的波动幅度变小,正常节律被破坏,而且随着病程进展MTR的表达逐渐下降甚至发生缺失;MTR是一种特异、高效的G蛋白耦联膜受体,有MTNR1和MTNR1B两种亚型,MT发挥生物效应依赖于与MTR的结合,依次与细胞内的一个或多个效应器系统相联系,给予T2DM患者MT治疗,可改善胰岛素抵抗,保护胰岛β细胞功能,调节血脂代谢。MT和其特异性受体进行结合通过信号转导发挥生物学效应,对抗体内过度磷酸化tau蛋白形成神经纤维缠绕,能够发挥保护神经元细胞完整性的作用〔14〕。研究发现,cAMP信号通路与机体认知功能下降有密切关系〔15〕;cAMP信号通路下游相关蛋白,包括蛋白激酶(PK)A〔16〕、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)〔17〕和BDNF〔18〕在机体的学习记忆形成中发挥重要作用〔19〕。cAMP作为细胞内重要的第二信使之一,主要参与真核细胞生物进行细胞信息转导,通过激活PKA使其磷酸化后开启基因表达,在记忆的形成过程中至关重要,细胞内cAMP过量的增加或减少都会造成学习记忆减低〔20,21〕。

BDNF是神经营养因子家族中的一员,主要在中枢神经内表达,对神经元分化、生长、发育发挥重要作用,同时能够修复受损神经元,改善学习及认知功能〔22～24〕。具体来说,BDNF支持海马体中的谷氨酸神经元,促进长期电位增强,从而促进长期记忆存储,并增强树突棘的生长和重组,以响应神经元活动变化,即BDNF对促进长期记忆和存储的持久性十分重要。相关研究表明,海马区BDNF可能在认知功能障碍中有重要保护作用〔25〕。学习记忆的重要解剖学基础与中枢神经系统相关,特别是与大脑边缘系统的重要组成部分-海马关系密切〔26〕。目前有研究认为大脑海马区中的nNOS可能参与了学习记忆的重要环节和过程,同时又是合成神经递质一氧化氮(NO)的关键酶〔27〕。研究发现,认知功能损伤后海马区nNOS阳性细胞数和积分光密度值明显降低〔28〕。

综上,健脾补肾化瘀胶囊可以改善海马组织病理形态学改变,调控影响认知功能相关蛋白MT、MTR、cAMP、BDNF、nNOS的表达,推测健脾补肾化瘀胶囊对老年T2DM大鼠的认知功能具有保护作用,可以有效延缓T2DM向DCD的发展。

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