沈越,孙靖烨,修彦凤,王海颖(上海中医药大学中药学院,上海 201203)
糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症之一。随着糖尿病患病率的升高,糖尿病肾病的患病率也随之升高,约30%的糖尿病患者面临终末期肾功能衰竭[1]。目前,高血糖和氧化应激被认为是导致糖尿病肾病进展的两个主要因素,体内持续高糖会中断多元醇途径以及线粒体呼吸链,使肾脏氧化应激水平提高,抑制线粒体修复功能,进而引起肾脏活性氧蓄积、线粒体损害及胰岛素抵抗,最终导致糖尿病肾病的发生[2-3]。糖尿病肾病早期的代谢变化如线粒体功能障碍早于肾纤维化及肾功能衰竭的发生[4-5]。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同激活因子1α(PGC-1α)不仅是线粒体生物合成的主要调节因子,在代谢稳态中发挥调节作用[6],也是多种组织中过氧化物酶体生物合成的正调节因子[7]。沉默信息调节因子1(Sirt1)是一种高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白脱乙酰酶[8],在肾脏特别是肾髓质中表达,并参与肾脏的生理病理过程[9]。研究[10]表明,Sirt1作为关键的能量调节因子,可以通过刺激内分泌信号影响糖脂代谢,并改善胰岛素分泌。此外,Sirt1还可以通过去乙酰化作用激活PGC-1α,从而提高PGC-1α的转录活性[11]。然而有研究[12-13]发现,在糖尿病小鼠肾脏组织中Sirt1及PGC-1α表达明显下调,PGC-1α作为Sirt1重要的下游靶标,其表达水平下降会引起肾功能障碍,加速氧化应激的发生。
本课题组前期研究[14]发现,复方鱼腥草乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位及水提物均对db/db小鼠肾损害具有保护作用。故本研究拟制备复方鱼腥草提取物(牛蒡子及鱼腥草的挥发油、水提物、醇提物的混合物),探讨其对高糖高脂联合低剂量链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病大鼠肾脏组织中Sirt1/PGC-1α通路的影响。
1.1 动物雄性SD大鼠50只,SPF级,体质量(200±20)g,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2018-0006。动物饲养于上海中医药大学实验中心SPF级实验室。本动物实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会审批,批文号:PZSHUTCM220822012。
1.2 药物及制备[15]鱼腥草(批号:190110)、牛蒡子(批号:180314),均购自上海康桥饮片有限公司。将牛蒡子打粉后与鱼腥草按1∶1配比,加入5倍量水、1/250的乙酸乙酯;
冷浸1 h后,用挥发油提取器提取4 h,得挥发油成分;
再用圆底烧瓶冷浸1 h后过滤,滤液为水提液;
滤渣加5倍量50%乙醇回流2 h,过滤,得醇提液;
将水提液、醇提液制成干燥药粉;
再将挥发油、水提物、醇提物混合即得复方鱼腥草提取物,4℃冰箱保存,1周内使用。
1.3 主要试剂STZ(批号:WXBC8740V),美国Sigma公司;
罗格列酮片(爱能,批号:20181211)、氨基甲酸乙酯(乌来糖,批号:20190228)、白藜芦醇(批号:20171122)、羧甲基纤维素钠(批号:20180702),均购自上海国药集团化学试剂有限公司;
尿肌酐试剂盒(批号:201741),富士胶片和光纯耀化学有限公司;
尿蛋白试剂盒(批号:221031301)、尿白蛋白试剂盒(批号:221102201)、血清肌酐试剂盒(批号:20180402),均购自宁波美康生物科技股份有限公司;
伊红溶液(B液,批号:230210)、苏木素溶液(批号:230210),均购自上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司;
β-actin抗体(批号:GB12001)、BCA蛋白定量检测试剂盒(货号:G2026)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(货号:G2003),均购自武汉赛维尔生物公司;
DAB显色剂(批号:K5007),丹麦DAKO公司;
GAPDH抗体(批号:60004),美国Proteintech公司;
Sirt1抗体(批号:bs-0921R),北京博奥森生物技术有限公司;
PGC-1α抗体(批号:ab54481),英国Abcam公司。
1.4 主要仪器7170型自动生化分析仪,日立(中国)有限公司;
活力型罗氏血糖仪,上海罗氏制药有限公司;
RM2135型石蜡切片机,德国Leica公司;
Rt2100c型酶标检测仪,深圳雷杜生命科学股份有限公司;
K100A型高速中药粉碎机,上海新诺仪器设备有限公司;
XSP-C204型显微镜,重庆光电仪器有限公司;
KZ-Ⅱ型匀浆仪,武汉赛维尔生物公司;
Neofuge13R型冷冻离心机,上海力康生物医疗科技公司;
DYY-6C型电泳仪,北京六一仪器厂。
1.5 2型糖尿病大鼠模型复制随机选取40只SD大鼠作为造模组,另外10只作为正常组。模型复制期间,正常组大鼠给予正常饲料喂养,造模组大鼠以高糖高脂饲料(70%基础饲料∶10%脂肪∶20%糖)喂养4周;
禁食不禁水12 h后,以小剂量腹腔注射1%STZ(30 mg·kg-1)进行模型复制。期间给予适量糖水以防止血糖过低。72 h后,大鼠禁食不禁水8 h,采用断尾法检测大鼠的空腹血糖值,空腹血糖值>11.1 mmol·L-1并伴有多饮、多食、多尿即为2型糖尿病大鼠模型复制成功。
1.6 分组、给药将模型复制成功的大鼠随机分为模型组、罗格列酮组(0.3 mg·kg-1)、白藜芦醇组(0.12 g·kg-1)及复方鱼腥草提取物组(生药4.5 g·kg-1,相当于成人每日鱼腥草、牛蒡子各30 g给药剂量),每组10只。各药物均用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成相应的给药浓度,给药体积均为4mL·kg-1,每天灌胃给药1次,连续给药8周。正常组、模型组灌胃(4 mL·kg-1)给予0.5%CMC-Na。给药期间,正常组给予正常饲料,其余各组均给予高糖高脂饲料。
1.7 样本采集及生化指标检测每2周用罗氏血糖仪测1次大鼠空腹血糖值。给药的第4周末、第8周末,采用代谢笼收集大鼠24 h尿液,记录尿量,保存于-80℃冰箱。给药8周后,禁食8 h,以20%乌来糖腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉取血,室温下静置1 h,以4℃、4 000 r·min-1(离心半径=6 cm)离心15 min,取上层血清。将大鼠尿液及血清样本送至上海中医药大学安全评价中心检测24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白、尿肌酐以及血清肌酐含量。计算:内生肌酐清除率=尿肌酐浓度×尿量/血肌酐浓度。解剖取各组大鼠双肾组织并称质量,计算:肾脏指数(%)=双肾平均质量(g)/体质量(g)×100%。
1.8 HE染色法观察肾脏组织病理形态学变化无菌条件下取各组大鼠右肾组织,用10%中性福尔马林固定后,经组织浸蜡、包埋、连续切片后,采用常规HE染色,于光镜下观察各组大鼠的肾脏组织病理变化。
1.9 免疫组化法检测肾脏组织中Sirt1表达水平大鼠肾脏组织石蜡切片经脱蜡、水化后,置于柠檬酸抗原修复缓冲液(pH=6.0)中进行抗原修复,然后用PBS(pH=7.4)摇床洗涤3次,每次5 min。用3%过氧化氢溶液(双氧水∶纯水=1∶9)室温下避光孵育25 min,PBS洗涤3次,每次5 min。3%BSA室温下封闭30 min后,加入PBS稀释的Sirt1一抗(1∶100),切片平放于湿盒内,4°C下孵育过夜。次日,PBS洗涤3次后,加入二抗,室温下孵育50 min。然后经DAB显色、Harris苏木素复染细胞核后脱水、封片,在光学显微镜下观察肾脏组织中Sirt1表达情况。苏木素染细胞核为蓝色,DAB显出的阳性表达为棕黄色。采用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片中阳性表达的统一标准,对照片进行分析,得到照片中阳性表达的累积光密度值(IOD)及组织的像素面积(AREA);
计算:平均光密度(Average optical,AO)值=IOD/AREA。AO值越大,表明Sirt1阳性表达水平越高。
1.10 Western Blot法检测大鼠肾皮质中Sirt1、PGC-1α蛋白表达水平取大鼠部分肾皮质组织,称定质量,PBS洗涤后剪碎;
加入RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂匀浆后,冰浴30 min,充分裂解后以12 000 r·min-1(离心半径=6 cm)离心10 min;
取上清液,采用BCA法测定蛋白浓度;
将蛋白溶液按照4∶1加入5×蛋白上样缓冲液,沸水浴变性15 min后,置于-20℃冰箱保存、备用。将总蛋白用裂解液稀释配制成所需浓度,经SDSPAGE电泳后,转移至PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭1.5 h;
洗膜后,分别加入一抗Sirt1(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、β-actin(1∶3 000)、GAPDH(1∶45 000),4℃下孵育过夜;
次日洗膜后,加入二抗(1∶3 000),室温下孵育30 min;
洗膜后,采用ECL溶液显影并扫描;
计算蛋白条带灰度值,以β-actin或GAPDH为内参,分析目的蛋白的相对表达量。
1.11 统计学处理方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析;
计量资料以均数±标准差(±s)表示;
多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠一般情况的影响与正常组比较,模型组大鼠精神状况较差,动作迟缓,体质量减轻,出现多饮、多尿、多食等现象。与模型组比较,复方鱼腥草提取物组大鼠的空腹血糖、体质量、进食量及饮水量均得到显著改善[15]。
2.2 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白水平的影响[16]结果见表1。与正常组比较,给药4、8周后,模型组大鼠的24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,复方鱼腥草提取物组大鼠的24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白水平明显降低(P<0.05)。
表1 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白水平的影响(±s,n=5)Table 1 Effects of compound Houttuyniae Herba extracton 24-hour urinary protein and urinary albumin in type 2 diabetic rats(±s,n=5)
表1 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白水平的影响(±s,n=5)Table 1 Effects of compound Houttuyniae Herba extracton 24-hour urinary protein and urinary albumin in type 2 diabetic rats(±s,n=5)
注:与正常组比较,#P<0.05;
与模型组比较,*P<0.05
组别正常组模型组白藜芦醇组罗格列酮组复方鱼腥草提取物组剂量/(g·kg-1)--0.12 0.3mg·kg-1 4.5 24 h尿蛋白/mg第4周63.34±16.68 226.82±34.29#283.70±80.62 273.28±95.24 79.40±9.19*第8周37.12±9.58 251.03±60.59#244.42±66.26 305.08±42.20 150.39±32.00*24 h尿白蛋白/mg第4周10.24±2.10 15.33±3.30#17.17±3.72 18.48±4.10 10.58±2.53*第8周6.70±2.14 14.35±1.25#10.18±2.13 18.18±5.64 8.16±3.03*
2.3 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肌酐清除率及肾脏指数的影响结果见表2。与正常组比较,模型组大鼠的肌酐清除率及肾脏指数明显升高(P<0.05),说明2型糖尿病大鼠的肾脏存在早期病变。与模型组比较,复方鱼腥草提取物组大鼠的肌酐清除率及肾脏指数明显降低(P<0.05),且与正常组比较无明显变化(P>0.05)。结果表明,复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠具有一定肾脏保护作用。
表2 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肌酐清除率及肾脏指数的影响(±s,n=5)Table 2 Effects of compound Houttuyniae Herba extract on creatinine clearance rate and renal index in type 2 diabetic rats(±s,n=5)
表2 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肌酐清除率及肾脏指数的影响(±s,n=5)Table 2 Effects of compound Houttuyniae Herba extract on creatinine clearance rate and renal index in type 2 diabetic rats(±s,n=5)
注:与正常组比较,#P<0.05;
与模型组比较,*P<0.05
组别正常组模型组白藜芦醇组罗格列酮组复方鱼腥草提取物组剂量/(g·kg-1)--0.12 0.3mg·kg-1 4.5肌酐清除率/(mL·min-1)2.31±0.38 3.61±0.81#3.78±1.20 3.76±0.74 2.29±0.47*肾脏指数/%0.30±0.02 0.51±0.04#0.43±0.09 0.52±0.06 0.36±0.07*
2.4 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肾脏组织病理变化的影响结果见图1。正常组大鼠的肾小球大小正常,形态规整,肾间质未见炎症浸润,系膜区无可见增生。与正常组比较,模型组大鼠的肾小球体积明显增大,可见肾间质伴有炎性细胞浸润,系膜区可见明显扩张。与模型组比较,复方鱼腥草提取物组大鼠的肾小球增大、系膜增生与基质聚积均有明显改善。
注:A.正常组;
B.模型组;
C.白藜芦醇组;
D.罗格列酮组;
E.复方鱼腥草提取物组。标尺=20μm图1 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肾脏组织病理变化的影响(HE染色,×400)Figure 1 Effect of compound Houttuyniae Herba extract on pathological changes of renal tissue in type 2 diabetic rats(HE staining,×400)
2.5 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肾脏组织中Sirt1表达的影响结果见图2。Sirt1阳性染色细胞表现为胞质被染成棕黄色,且主要在肾间质中表达。与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织中的Sirt1表达显著下调(P<0.01)。与模型组比较,复方鱼腥草提取物组大鼠肾脏组织中的Sirt1表达显著上调(P<0.01)。
注:A.正常组;
B.模型组;
C.白藜芦醇组;
D.罗格列酮组;
E.复方鱼腥草提取物组。标尺=20μm。与正常组比较,##P<0.01;
与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图2 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肾脏组织中Sirt1表达的影响(免疫组化,×400;
±s,n=3)Figure 2 Effect of compound Houttuyniae Herba extract on Sirt1 expression in renal tissue of type 2 diabetic rats(IHC,×400;
±s,n=3)
2.6 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肾皮质中Sirt1、PGC-1α蛋白表达的影响结果见图3。与正常组比较,模型组大鼠肾皮质中Sirt1、PGC-1α蛋白表达均明显下调(P<0.05)。与模型组比较,复方鱼腥草提取物组大鼠肾皮质中Sirt1、PGC-1α蛋白表达均明显上调(P<0.05,P<0.01)。
注:A.正常组;
B.模型组;
C.白藜芦醇组;
D.罗格列酮组;
E.复方鱼腥草提取物组。与正常组比较,#P<0.05;
与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图3 复方鱼腥草提取物对2型糖尿病大鼠肾皮质中Sirt1、PGC-1α蛋白表达的影响(±s,n=4)Figure 3 Effectof compound Houttuyniae Herba extract on the protein expressions of Sirt1 and PGC-1αin renal cortex of type 2 diabetic rats(±s,n=4)
糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症,是慢性肾脏病和终末期肾脏病的主要病因[16]。中医认为,糖尿病肾病属于“水肿”“虚劳”“脾瘅”等疾病范畴,患者多体虚,气阴损耗,兼夹痰、热、郁、瘀等因素[17]。复方鱼腥草合剂以鱼腥草、牛蒡子配伍,具有清热解毒的功效,可以改善糖尿病肾病大鼠的肾小球足细胞损伤,改善肾小球滤过功能,减少蛋白尿,减轻糖尿病肾病的病理损害,对糖尿病肾病的防治有积极作用[18]。复方鱼腥草提取物能够降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖水平,改善胰岛素抵抗,对db/db小鼠肾损伤的改善作用可能与调节JAK/STAT-SOCS-1通路有关[15]。
目前,肾小球滤过率(GFR)是评价肾小球功能的重要指标,而24 h内源性肌酐清除率公式作为GFR的理论公式之一,已被广泛应用于临床。在糖尿病肾病的早期诊断中,24 h尿蛋白、尿白蛋白的联合检测可作为提示肾实质损伤部位和程度的参考指标[19]。研究[20-21]表明,与正常组比较,糖尿病大鼠的肾脏指数显著升高,可作为肾脏肥大、组织功能发生改变的提示指标。本研究结果显示,复方鱼腥草提取物可以显著降低2型糖尿病大鼠24 h尿蛋白、尿白蛋白的水平,降低肌酐清除率及肾脏指数,明显改善肾小球和肾间质病变,表明复方鱼腥草提取物对糖尿病肾病的早期肾损伤具有一定的保护作用。
白藜芦醇被证明可以改善糖尿病诱导的OVE26小鼠的肾小球足细胞丢失和氧化应激,改善线粒体功能,发挥肾脏保护作用[22]。罗格列酮是少数有效治疗糖尿病肾病,特异性治疗胰岛素抵抗和改善代谢综合征,并降低血糖的药物之一[23-24]。本课题组前期研究[18]也显示,罗格列酮可显著降低糖尿病肾病大鼠的空腹血糖值。但本研究中白藜芦醇、罗格列酮对2型糖尿病大鼠24 h尿蛋白、24 h尿白蛋白水平、肌酐清除率及肾脏指数无显著影响,可能与给药剂量有关[25-27],有待后续研究进一步证实。
研究[28]表明,阿霉素刺激肾小球足细胞48 h后,PGC-1α蛋白表达显著下调,并抑制线粒体功能,从而诱导肾脏足细胞损伤,而在PGC-1α过表达的足细胞中,可以显著抑制阿霉素所引起的细胞损伤以及线粒体功能障碍,从而发挥一定保护作用。此外,PGC-1α还能增强胰岛素灵敏度并改善线粒体功能[29]。Sirt1是一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶,具有抗衰老、改善糖脂代谢、调节胰岛素敏感性等多种生物学功能[30]。有研究[31-33]报道,糖尿病肾病中肾小球Sirt1表达水平降低,尿白蛋白增加,而当足细胞特异性Sirt1过表达时,可改善肾小球氧化应激,从而防止活性氧生成,减少氧化损伤及抑制肾纤维化,提示Sirt1蛋白表达对糖尿病肾病的发生发展起着重要作用。此外,Sirt1可使PGC-1α脱乙酰,从而提高PGC-1α的转录活性。本研究结果显示,2型糖尿病大鼠肾皮质中Sirt1、PGC-1α蛋白表达均明显下调,而复方鱼腥草提取物能够上调Sirt1、PGC-1α蛋白表达。提示复方鱼腥草提取物改善糖尿病肾病大鼠的肾功能可能与调节Sirt1/PGC-1α通路有关。
综上所述,复方鱼腥草提取物可以降低2型糖尿病大鼠24 h尿蛋白、尿白蛋白水平,降低肌酐清除率及肾脏指数,减轻肾脏组织的病理损害,对糖尿病肾病大鼠的早期肾脏损伤具有保护作用,其机制可能与上调肾皮质中Sirt1/PGC-1α通路有关。
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