基于转录组测序的苦瓜皂苷合成相关基因的鉴定和分析

戚仁洁，宁宇，刘静，刘之洋，徐海，罗志丹，陈龙正

基于转录组测序的苦瓜皂苷合成相关基因的鉴定和分析

1江苏海洋大学药学院/江苏省海洋生物资源与环境重点实验室/江苏省海洋药物化合物筛选重点实验室，江苏连云港 222005；
2江苏海洋大学/江苏海洋生物产业技术协同创新中心，江苏连云港 222005；
3江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京 210014

【目的】皂苷是苦瓜果实苦味的主要来源，具有降血糖、抗癌等多种药用价值。鉴定和挖掘参与调控苦瓜皂苷生物合成的代谢通路及基因，为进一步深入解析苦瓜皂苷形成的分子机制提供参考。【方法】以苦瓜高代自交系GK24为试验材料，分别在子房期（T1）、幼果期（T2）、商品果期（T3）和完全成熟期（T4）取果实组织，通过香草醛-冰醋酸法测定不同时期的苦瓜皂苷含量，利用转录组测序的方法鉴定差异表达基因。【结果】从T1到T4，苦瓜内源皂苷含量随着果实发育而呈现显著下降的趋势。转录组测序共鉴定到17 504个基因，在T1-vs-T2、T2-vs-T3和T3-vs-T4三组比较中，下调表达基因数量均高于上调表达基因数量。GO富集分析表明含磷复合物代谢过程、驱动蛋白复合体和2-琥珀酰-6-羟基-环己二烯-1-羧酸合成酶活性分别是生物过程、细胞组分及分子功能模块最显著富集的条目。KEGG分析显示全局与概述图谱、碳水化合物代谢和氨基酸代谢是3组比较中共同的最显著富集的代谢通路。根据表达模式可将基因划分为20个模块，其中profile 0中基因的表达量从T1到T4逐渐降低，与苦瓜果实发育过程中皂苷含量变化规律一致。从profile 0中鉴定出与苦瓜皂苷生物合成相关的基因14个，包括萜类骨架生物合成通路上的基因、、、、和，倍半萜与三萜生物合成途径中的基因、和及后修饰酶基因、、及。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果与RNA-seq结果一致。【结论】苦瓜果实中皂苷含量随着果实不断成熟而逐渐降低。苦瓜皂苷生物合成首先通过上游的萜类骨架生物合成（ko00900）代谢途径完成萜类皂苷骨架的积累，随后通过倍半萜与三萜生物合成（ko00909）代谢途径以及下游的氧化还原酶、糖基转移酶的修饰最终生成皂苷，本研究通过转录组测序共鉴定到14个与苦瓜皂苷生物合成相关的基因。

苦瓜；
转录组；
差异表达基因；
皂苷；
合成调控

【研究意义】苦瓜为葫芦科苦瓜属一年生草本植物，药食兼用，在我国华南地区广泛种植[1]。现代化学成分和药理学研究表明，苦瓜中主要富含多糖、多肽、皂苷、黄酮、酚类等物质，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎和免疫保护等多种药理作用[2]。其中，皂苷是苦瓜主要活性成分之一，具有降血糖、抗癌等药用价值[3]。因此，挖掘苦瓜皂苷生物合成的相关基因，揭示苦瓜皂苷合成调控的分子机理，对提高苦瓜药用价值具有重要的理论意义。【前人研究进展】皂苷是植物中普遍存在的一类化合物，是由皂苷元加上一个或多个糖基构成。根据皂苷水解后生成皂苷元的结构，可分为三萜类与甾体类皂苷[4]。近年来，从不同种类苦瓜的各类组织中提取到的皂苷种类超过40种，如从种子中分离苦瓜皂苷A、B、C、D和E[5]，其中大部分皂苷为四环三萜类的葫芦烷型[6]。苦瓜的苦味主要来自其体内的多种葫芦烷型三萜化合物，也称为葫芦素类化合物[7]，目前已被证明具有苦味的为苦瓜皂苷元类的MomordicinesⅠ和Ⅱ[8]以及苦瓜皂苷Momordicoside K和L[9]。与其他葫芦科作物苦味物质相比，苦瓜苦味物质的特点是无毒性和可食性。植物中三萜类化合物的生物合成过程[10]是首先通过甲羟戊酸途径（mevalonate，MVA）或者2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（2-C-methl-Derythritol-4- phospate，MEP）生成异戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），IPP与异构化的二甲烯丙基焦磷酸（iimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）在法尼基焦磷酸合酶（farnyl pyrophosphate synthase，FPS）的催化下形成法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP），随后通过角鲨烯合酶（squalene synthase，SS）、角鲨烯环氧化酶（squalene monooxygenase，SM）的催化形成2,3-氧化角鲨烯（2,3- oxidosqualene，OS）。OS在氧鲨烯环化酶（oxidosqualene cyclases，OSCs）的催化下形成三萜类化合物的基本骨架，随后进一步在各种氧化还原酶、糖基转移酶、甲基转移酶和酰基转移酶等的修饰下形成三萜类皂苷[11]。随着“下一代”测序技术（next-generation sequencing，NGS）的不断进步，转录组测序技术（RNA sequencing，RNA-seq）凭借着高通量的特点在快速鉴定生物体特定状态下的全局转录本上发挥着重要作用。目前，RNA-seq技术已经广泛应用于药用植物活性成分的代谢通路鉴定和次生代谢关键酶基因的挖掘[12]，如海南龙血树[13]、总序天冬[14]、西藏延龄草[15]等已通过RNA-seq技术解析了活性成分甾体皂苷的生物合成途径并鉴定到相关的合成基因[16]。【本研究的切入点】苦瓜皂苷合成是由多基因控制的复杂的生物学过程，目前，尚未见相关基因的报道，具体的分子调控机理也不明晰。【拟解决的关键问题】以苦瓜高代自交系GK24为试验材料，对其果实形成过程中4个不同发育阶段（子房期、幼果期、商品果期和完全成熟期）进行皂苷含量测定及高通量转录组测序分析；
通过比较，挖掘与苦瓜皂苷生物合成相关的通路及基因。

1.1 材料处理

试验于2023年在江苏省农业科学院蔬菜研究所进行，试验材料为本课题组保存的苦瓜高代自交系GK24。分别在子房期（T1，开花前1 d）、幼果期（T2，授粉后7 d）、商品果期（T3，授粉后15 d）及完全成熟期（T4，授粉后25 d，果皮变黄，种子成熟）取果实作为样品。每棵苦瓜单株上取3个果实作为一个生物学重复，试验共设置3次重复。样品采摘后迅速放入液氮中进行速冻，随后放入超低温冰箱中保存，用于后续的苦瓜皂苷含量测定及转录组分析。

1.2 苦瓜皂苷提取及含量测定

苦瓜样品首先进行冷冻干燥，粉碎后过80目筛得到干粉。准确称取苦瓜干粉600 mg，分别置于100 mL三角锥形瓶中，加入30 mL 75%乙醇溶液，用保鲜膜封住瓶口，在60 ℃、频率40 kHz、功率400 W条件下超声震荡1 h，超声结束后冷却至室温，溶液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，再次重复上述步骤。将两次收集到的滤液，在68℃、100 MPa条件下减压蒸去乙醇后，加甲醇溶解定容至25 mL容量瓶中，即得苦瓜皂苷待测溶液[17]。

苦瓜皂苷含量测定采用香草醛-冰醋酸法[18]。称取人参皂苷Rg1标准品20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解定容，得标准品溶液（2 mg∙mL-1）。将标准品溶液依次稀释，分别取40、80、120、160和200 μL于试管中，各加0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，混匀，封口，65 ℃水浴加热20 min，冰浴冷却15 min，各加冰醋酸溶液5 mL，摇匀，于546 nm处测定吸光度。以样品质量浓度（mg∙mL-1）为横坐标，以吸光度（Abs）为纵坐标进行分析，绘制标准曲线，求得回归方程：=28.576+0.0008。准确吸取苦瓜T1、T2、T3、T4的待测样品溶液200 μL于10 mL试管中，同标准曲线制作方法，在最大吸收波长处测定吸光度。通过标准曲线计算对应的质量浓度。

1.3 RNA提取、cDNA文库构建及转录组测序

利用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取苦瓜样品总RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的降解和污染程度。使用Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，CA，USA）检测RNA的浓度、纯度和完整性。质量合格的RNA使用NEB Next Ultra RNA Library Prep Kit试剂盒（NEB #7530，MA，USA）构建cDNA文库。12个cDNA文库在Illumina Novaseq6000平台上进行测序，该工作委托广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.4 差异表达基因鉴定与功能注释分析

对原始数据进行质量控制，过滤掉接头和低质量的reads，获得高质量的clean reads。使用HISAT2软件将获得的clean reads比对到苦瓜参考基因组上[19]。以每千个碱基的转录每百万映射读取的片段（FPKM）值为指标，用RSEM软件检测基因和转录表达水平。使用DEseq2软件进行差异表达分析，将FDR＜0.05且|log2(fold change)|＞1的基因作为显著差异基因（DEGs）。对DEGs进行GO富集和KEGG分析，将-value≤0.05的GO和KEGG通路看作是显著富集的通路。

1.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

从转录组结果中选取显著差异表达并且在与三萜化合物合成相关的代谢通路上的候选基因，进行qRT-PCR检测，验证转录组数据的可靠性。以为内参基因，利用Primer 3.0软件设计各基因特异的qRT-PCR引物（表1）。反应体系为20 μL：cDNA模板1 μL，2×ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，加ddH2O补至20 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性120 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。采用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。每组样品设置3次重复。

表 1 qRT-PCR引物序列

2.1 不同成熟期苦瓜皂苷含量变化

T1时期皂苷含量最高，为0.355 mg/100mg，T4时期皂苷含量最低，为0.035 mg/100mg（图1）。从T1时期至T4时期，苦瓜皂苷含量随着果实发育进程呈现逐渐降低的趋势，不同时期间含量差异显著（＜0.05）。

2.2 转录组测序数据统计

利用Illumina Novaseq 6000平台对4个时期（T1、T2、T3和T4）的苦瓜进行转录组测序，共获得99.71 Gb数据。对得到的raw reads进行过滤，去除接头序列、未知序列及低质量序列，获得clean reads（表2）。统计结果显示各样品Q30均大于91.96，GC%含量介于46.30%—47.30%。将clean reads比对到苦瓜三代参考基因组上，发现所有样品的比对率均大于95.88%，其中单一比对序列的比例均大于92.75%，表明测序质量较高，可用于后续的分析。

不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）

2.3 样本相关性分析

对4个时期的苦瓜果实样品转录组数据进行PCA分析，结果显示，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）可分别解释71%和16%的方差，累计贡献率达到了87%，能够较好地解释苦瓜转录表达差异。由图2还可以看出，同时期样品聚集在一起，而不同时期样品则明显分离，表明样品组内重复性好且组间差异明显，证明数据较为可靠，可以用于进一步比较分析。此外，还发现T2和T3两个时期的样品关系较为接近，而与T1和T4的差异比较明显。

图2 转录组数据的主成分分析图

表2 转录组测序数据统计

2.4 差异表达基因（DEGs）的鉴定与分析

通过转录组测序共鉴定到17 504个基因，其中有12 787个在苦瓜4个生长时期中共同表达，而在T1、T2、T3和T4每一个时期特异表达的基因分别有527、165、191和419个（图3-A）。以FDR＜0.05且|log2FC|＞1为标准，通过比较相邻两个时期分析苦瓜果实在生长发育过程中的变化和差异（图3-B）。在T1-vs-T2组中，共鉴定到5 048个DEGs，其中上调表达的2 396个，下调表达的2 652个。在T2-vs-T3组中，共鉴定到3 626个DEGs，其中上调表达的1 649个，下调表达的1 977个。在T3-vs-T4组中，共有7 127个基因差异表达，其中上调表达的2 156个，下调表达的4 971个。此外，发现在每一组比较中下调的DEGs数目均高于上调的DEGs数目。

A：差异表达基因韦恩图；
B：不同时期上调和下调差异表达基因数目

2.5 差异表达基因的GO富集分析

为深入了解苦瓜果实发育过程中DEGs的主要生物学功能，本研究对DEGs进行了GO富集分析，主要分为生物过程（biological process）、细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）3个功能大类，包含63个功能亚类（图4）。

图4 苦瓜果实不同发育时期的GO功能热图

在生物过程中，3组比较的DEGs均主要富集在甘油磷脂代谢、含磷化合物代谢、氧化应激反应、脂质生物合成、二磷酸核苷代谢和细胞壁大分子代谢过程。多糖定位功能、MAP激酶活性的调节、心皮形态发生、发育细胞生长、DNA生物合成等过程主要在T1-vs-T2时期显著富集，而苯丙氨酸代谢、糖苷代谢、黄嘌呤代谢和胞嘧啶C-5甲基化等过程则特异地富集在T3-vs-T4时期。在细胞组分中，基驱动蛋白复合体是三组比较中均显著富集的过程。在分子功能中，三组比较的DEGs均主要富集在酸性硫醇连接酶活性和2-丁酰基-6-羟基-2,4-环己二烯-1-羧酸合酶活性上。此外，微丝运动活性、肌动蛋白结合、离子结合和镁原卟啉-6-甲基转移酶活性主要在T1-vs-T2时期显著富集，而乙酰辅酶A C-酰基转移酶活性、十二碳烯酰基CoA-delta异构酶活性、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）活性、葡糖醛酸基转移酶活性和三烷基锍水解酶活性等则特异地富集在T3-vs-T4时期。

2.6 差异表达基因的KEGG通路分析

本研究利用KEGG数据库对苦瓜果实发育过程中DEGs参与的代谢通路进行了注释和分析。在代谢类的通路中，DEGs最显著地富集在全局与概述图谱中，3组比较分别富集了581、460和910个DEGs，随后依次是碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（amino acid metabolism）、脂质代谢（lipid metabolism）等。萜类化合物和聚酮类化合物的代谢（metabolism of terpenoids and polyketides）在T1-vs-T2、T2-vs-T3和T3-vs-T4三组比较中分别鉴定到61、56和83个差异表达基因（图5）。此外，在环境信息处理类的通路中，信号转导通路也显著富集，3组比较分别鉴定到122、80和159个差异表达基因。

图5 苦瓜果实不同发育时期差异表达基因的KEGG富集

2.7 表达趋势分析

为区分基因在苦瓜果实发育过程中不同的表达趋势，本研究利用STEM软件将基因按照表达模式共分为20个不同的模块（图6）。Profile 0中共有基因2 548个，均呈连续下调趋势，而profile 19则包含1 194个基因，从T1至T4呈连续上调表达的趋势。由于profile 0中的基因表达趋势与苦瓜果实生长过程中皂苷含量变化规律相吻合，因此，将profile 0中的2 548个基因与KEGG数据库进行比对。结果显示（表3），2 548个基因中有597个在KEGG数据库中得到注释，主要显著富集在核糖体、同源重组、DNA复制和氨基酸生物合成等通路上。值得注意的是，Profile 0中与皂苷类化合物生物合成相关的代谢途径萜类骨架生物合成（ko00900）也显著富集（=0.0173777），共包含14个基因。

图6 苦瓜果实不同发育时期基因表达趋势图

表 3 Profile 0中显著富集的代谢通路

2.8 苦瓜皂苷合成相关基因的鉴定

根据现有研究，与三萜皂苷生物合成相关的代谢通路主要包括萜类骨架生物合成（ko00900）和倍半萜与三萜生物合成（ko00909）。本研究中，profile 0中分别有14和4个基因富集在这两条途径上（表4）。其中，甲羟戊酸途径（MVA途径）中共鉴定到7个基因，分别为乙酰辅酶A乙酰转移酶基因（，evm.TU.chr4.352）、HMG-CoA合成酶基因（，evm.TU.chr4.378）、甲羟戊酸激酶基因（，evm.TU.chr8.4201）、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因（，evm.TU.chr9.3672）、磷酸甲羟戊酸激酶基因（，evm.TU.chr10.2918、evm.TU.chr6.363）和法尼基焦磷酸合酶1基因（，evm.TU.chr1.608），这些基因的表达量从T1到T4时期均呈现逐渐下调的趋势。此外，从甲基赤藓醇磷酸途径（MEP途径）中鉴定到1个编码1-脱氧-D-酮糖5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，DXR）基因（evm.TU.chr6.140），其表达量也随着果实发育过程而逐渐下调。倍半萜与三萜生物合成通路中的基因位于苦瓜皂苷合成途径中游，其中的关键酶基因如角鲨烯合成酶（，evm.TU.chr2.1021）、角鲨烯环氧酶（，evm.TU.chr8.588）、葫芦烷二烯合酶（，evm.TU.chr7.10）的表达量也随着果实发育进程而逐渐降低。此外，在下游途径还鉴定到4个三萜骨架后修饰基因，分别为CYP450（cytochrome P450）家族中的（evm.TU.chr10.601）（evm.TU.chr3.3014）和UDP糖基转移酶（UDP glycosyltransferases，UGTs）家族中的（evm.TU.chr9.3663）（evm.TU.chr1.2272），从T1到T4时期这4个基因表达量也呈逐渐下调趋势（图7）。

表4 Profile 0中ko00900和ko00909通路中的基因

热图表示不同发育时期基因的FPKM值，颜色越红，数值越高；
从左到右样本依次为T1、T2、T3和T4

2.9 qRT-PCR验证RNA-seq数据可靠性

为验证转录组结果的准确性，本研究选取了在萜类骨架生物合成（ko00900）和倍半萜与三萜生物合成（ko00909）中9个与苦瓜皂苷合成相关的基因进行qRT-PCR验证。结果显示，萜类骨架生物合成（ko00900）通路中的法尼基焦磷酸合酶I（farnesyl pyrophosphate synthase I，）、甲羟戊酸激酶（mevalonate kinase，）和磷酸甲羟戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，），倍半萜与三萜生物合成（ko00909）通路中的葫芦烷二烯合酶（cucurbitadienol synthase，）和角鲨烯环氧酶（squalene monooxygenase1，）及三萜骨架后修饰基因、及的表达量从T1到T4呈现逐渐降低的趋势，与RNA-seq结果基本一致（图8）。此外，研究还发现这些皂苷合成相关基因的表达趋势与苦瓜皂苷含量的变化趋势相一致，均随着果实发育过程而逐渐降低。

图8 qRT-PCR验证苦瓜皂苷合成相关基因的表达

3.1 苦瓜皂苷含量随着果实发育呈现逐渐下降的趋势

苦瓜皂苷是苦瓜苦味的主要来源，为了明确苦瓜皂苷在果实发育过程中的合成规律，本研究测定了子房期、幼果期、商品成熟期和种子成熟期等4个关键时期的皂苷含量，结果表明苦瓜果实中皂苷生物合成作用会随着发育过程逐渐减弱，这也为苦瓜皂苷的提取与利用提供了参考依据，即苦瓜果实采收宜早不宜晚。在其他药用植物中也存在与本研究类似的结果，如在西洋参花蕾4个发育时期中（现蕾期、发展期、成熟期、开花期），现蕾期的总皂苷含量最高，而随着西洋参花蕾的不断发育，总皂苷含量降逐渐低[20]。然而，造成这一现象的原因尚不清楚，推测可能与果实成熟过程中部分次生代谢物会向种子转运和积累有关。

3.2 苦瓜三萜类皂苷生物合成相关基因的鉴定

本研究发现每两个相邻时期的下调基因数目均高于上调基因数目，这也部分说明苦瓜果实成熟过程中某些生物合成作用是逐渐减弱的。而在其他植物中也存在着类似的现象。番茄果实的转色期与绿熟期相比，上调表达基因为2 057个，下调表达基因为4 480个，而红熟期与转色期相比获得4 587个DEGs，其中2 042个上调，2 545个下调，随着番茄果实的不断成熟，下调基因多于上调基因[21]。在辣椒果实成熟过程中，花后35 d辣椒果实和花后16 d辣椒果实相比，17.27%的基因上调表达，而82.73%的基因则下调表达[22]。

本研究发现profile 0中的基因从T1到T4表达量呈现逐步降低的趋势，与皂苷含量变化规律相一致，推测该模块中的基因可能与苦瓜皂苷生物合成相关。进一步发现萜类骨架生物合成和倍半萜与三萜生物合成通路可能与苦瓜皂苷三萜类化合物合成相关，并从中鉴定到9个关键酶、10个差异表达基因。植物三萜类化合物主要是通过MVA和MEP途径合成三萜类化合物骨架，随后经过不同关键修饰酶修饰形成不同结构类型的三萜类化合物。在苦瓜果实发育过程中，萜类骨架生物合成MVA途径的、、、、、，倍半萜与三萜生物合成通路中的、等基因的表达丰度呈逐渐下降的趋势，而MEP途径中的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（1-Deoxyxylulose 5-phosphate Synthase，）、2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cysteine transferase，）、4-(5"-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶（4-(5"-Cytidine pyrophosphate) -2-C-methyl-D-erythritol kinase，）、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶（2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclic pyrophosphate synthase，）和4-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶（4-hydroxy-2- methyl-2-E-buten-4-pyrophosphate reductase，）等基因的表达模式与苦瓜皂苷含量变化规律不一致（图7），因此，推测苦瓜三萜类皂苷骨架生物合成以MVA途径为主。

3.3 苦瓜三萜类皂苷生物合成通路的预测

植物三萜皂苷生物合成过程十分复杂，包含20余步酶促反应[23]。首先通过MVA和MEP途径生物合成三萜类化合物骨架，随后经过葫芦素合成酶（CPQ）、细胞色素P450酶和糖基转移酶等关键修饰酶修饰形成不同结构类型的三萜类皂苷[23]，因此，鉴定关键合成酶与修饰酶对解析皂苷生物合成代谢通路十分重要。例如，通过对115份黄瓜核心种质进行全基因组关联分析（GWAS）鉴定到1个与叶片苦味紧密连锁的SNP位点，该位点变异导致编码的2,3-氧化角鲨烯环化酶（OSC）第393位的氨基酸从半胱氨酸变为酪氨酸，叶片从苦变成不苦[24]。研究发现OSC与西葫芦中发现的葫芦素合成酶（CPQ）的同源性高达80%[25]。罗汉果甜苷是在药用植物罗汉果果实中发现的葫芦烷型四环三萜皂苷[26]，其生物合成途径可以分为3个过程，首先通过MVA或MEP途径生成异戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）；
其次，在一系列酶的催化下生成2,3-氧化鲨烯，2,3-氧化鲨烯在葫芦二烯醇合酶的作用下生成葫芦二烯醇；
随后，葫芦二烯醇在细胞色素P450酶家族中的CYP87D18[27]和糖基转移酶家族中的UGT720-269-1和UGT94-289-3的作用下[28]依次形成罗汉果醇和罗汉果苷。五加科植物人参中的人参皂苷主要以达玛烷型三萜皂苷为主，达玛烷型四环三萜皂苷的共同前体是2,3-环氧鲨烯，首先通过达玛烯二醇合酶（dammarenediol-Ⅱ synthase，DS）催化生成达玛烯二醇（dananediol，DM），随后在细胞色素P450酶（CYP450）的作用下生成原人参二醇（protopanaxadiol，PPD）和原人参三醇（protopanaxatriol，PPT），最后通过糖基转移酶（UGT）进行糖基化修饰[29]。

植物三萜类化合物和三萜皂苷的合成有着共同的前体合成途径，但具有高度特异性和多样性的后修饰作用，从而使不同植物中最后的三萜皂苷产物形成都有各自的规律[30]。参考植物三萜皂苷合成通路[31-33]，本研究对苦瓜三萜皂苷可能的生物合成途径进行了推测：苦瓜三萜类皂苷合成主要通过甲羟戊酸途径，以乙酰辅酶A（acetyl-CoA）为起始底物，经过HMG-CoA合成酶HMG1（evm.TU.chr4.378）、甲羟戊酸激酶MVK（evm.TU.chr8.4201）、磷酸甲羟戊酸激酶PMK（evm.TU.chr10.2918，evm.TU.chr6.3631）、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD2（evm.TU.chr9.3672）等一系列关键酶的催化作用反应生成异戊烯焦磷酸（IPP），IPP在香叶基焦磷酸合成酶（GPS）的作用下经过缩合生成香叶基焦磷酸（GPP），GPP在法尼基焦磷酸合酶1（FPS1）的催化下再加入第2个IPP单元生成法尼基焦磷酸（FPP），2个FPP经角鲨烯合成酶SS12（evm.TU.chr2.1021）缩合形成鲨烯，随后在角鲨烯环氧酶SQE1（evm.TU.chr8.588）的作用下环氧化生成2,3-氧化鲨烯，通过船式构象形成同分异构体，在葫芦烷二烯醇合酶CPQ（evm.TU.chr7.10）的调控下生成葫芦烷二烯醇。

葫芦烷二烯醇是葫芦烷型四环三萜类化合物的骨架，经过氧化还原酶、甲基转移酶、酰基转移酶和糖基转移酶等多种修饰酶的调控，最终形成苦瓜四环三萜类皂苷。其中最常见的氧化还原酶为CYP450（cytochrome P450）家族，对骨架结构进行氧化还原作用，引入羟基、醛基、羧基及环氧基团等，为进一步的其他修饰奠定基础，因此，CYP450的氧化作用往往发生在其他修饰作用之前。本研究也鉴定到了2个CYP基因，分别为和，其表达随着果实发育进程呈现逐渐下降的趋势，推测其参与了苦瓜葫芦烷二烯醇的后修饰过程。苦瓜皂苷的形成需要经过糖基化修饰，因此，UDP糖基转移酶（UDP glycosyltransferases，）在这一过程中发挥着重要作用。Kim等[34]通过转录组测序技术对MeJA诱导人参毛状根培养物的转录组进行了分析，筛选出与人参皂苷生物合成相关的差异表达UGTs基因和等。本研究中也鉴定到2个UGT基因（和），其表达量从T1到T4呈现逐渐降低的趋势，与苦瓜皂苷含量变化规律一致，推测其可能参与了苦瓜三萜类皂苷的合成。

本研究发现苦瓜皂苷含量随着果实发育成熟而呈现下降的趋势。通过转录组分析共鉴定到17 504个基因，按照表达模式将这些基因分成20个模块，其中profile 0中基因的表达趋势与苦瓜皂苷含量变化规律相一致，进一步从中鉴定到14个与萜类化合物合成相关的基因，分别为萜类骨架合成通路中的、、、、和，倍半萜与三萜生物合成通路中的、和以及后修饰基因、、及。基于上述鉴定到的基因，初步预测了苦瓜皂苷合成可能的调控通路。

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Identification and Analysis of Genes Related to Bitter Gourd Saponin Synthesis Based on Transcriptome Sequencing

1College of Pharmacy/Jiangsu Key Laboratory of Marine Biological Resources and Environment/Jiangsu Key Laboratory of Marine Pharmaceutical Compound Screening, Jiangsu Ocean University, Lianyungang222005, Jiangsu;2Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology/Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, Jiangsu;3Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences /Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014

【Objective】As the main source of bitterness in bitter gourd fruit, saponin possesses various medicinal values including hypoglycemic and anticancer properties. This paper aimed at identifying the metabolic pathways and genes involved in the regulation of bitter gourd saponin biosynthesis, so as to provide the theoretical basis for further analysis of the molecular mechanism of bitter gourd saponin formation.【Method】Using the bitter gourd high-generation inbred line GK24 as the test material, fruit tissues were sampled at the ovary stage (T1), young fruit stage (T2), commodity fruit stage (T3), and maturity fruit stage (T4). The saponin content of bitter gourd at different periods were determined by the vanillin-glacial acetic acid method, and the differentially expressed genes (DEGs) were identified using the method of transcriptome sequencing. 【Result】From T1 to T4, the endogenous saponin content of bitter gourd showed significant decrease with fruit development. A total of 17 504 genes were identified by transcriptome sequencing, and the number of down-regulated genes was higher than that of up-regulated genes in the comparison of the three groups of T1-vs-T2, T2-vs-T3, and T3-vs-T4. GO enrichment analysis showed that phosphorus-containing complex metabolic process, kinesin complex and 2-succinyl-6-hydroxy-cyclohexadiene-1-carboxylic acid synthetase activity were the most significantly enriched terms in biological process, cellular component and molecular function, respectively. KEGG analysis showed that global and overview mapping, carbohydrate metabolism, and amino acid metabolism were the most significantly enriched pathways in all three comparative groups. The genes could be categorized into 20 profiles based on their expression patterns. Genes in profile 0 gradually decreased from T1 to T4, showing similar pattern of saponin content changes with bitter gourd fruit development. 14 genes related to bitter gourd saponin biosynthesis were identified from profile 0, including,,,,, and,, andin the sesquiterpene and triterpene biosynthesis pathway, and the postmodifying enzyme genes,,and. The results of RNA-seq were validated by qRT-PCR method.【Conclusion】The saponin content of bitter gourd decreased with the fruit development. Bitter gourd saponin was synthesized through the terpenoid bone biosynthesis (ko00900) metabolic pathway to accumulate terpenoid saponin skeleton in the first, and then produce saponins through the sesquiterpene and triterpene biosynthesis (ko00909) metabolic pathway and the modification of oxidoreductase and glycosyltransferase successively. A total of 14 genes related to the saponin biosynthesis of bitter gourd have been identified in the present study.

bitter gourd; transcriptome; differentially expressed genes; saponin; regulation of synthesis

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.09.012

2023-09-29；

2023-12-18

国家自然科学基金（32102392）、江苏省重点研发计划（Be2022339）、江苏省自然科学基金（BK20200279）、江苏省农业科技自主创新资金项目（CX(21)3027）

戚仁洁，E-mail：13956705571@163.com。宁宇，E-mail：20190022@jaas.ac.cn。戚仁洁和宁宇为同等贡献作者。通信作者罗志丹，E-mail：lzd@jou.edu.cn。通信作者陈龙正，E-mail：longzhengchen@qq.com

（责任编辑 赵伶俐）

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