天然橡胶中蛋白质二级结构及热变性*

王春润,王 妍,常美玲,刘 荣,常 明,张 勇,于宏伟,徐元媛**

(1. 河北科技大学 化学与制药工程学院,河北 石家庄 050018;2.石家庄学院 化工学院,河北 石家庄 050035)

天然橡胶(NR)是一类天然高分子化合物,主要以顺-1,4-异戊二烯为主体,同时也含有一定量的蛋白质,这也是NR与合成橡胶的一个区别[1-2]。蛋白质对NR硫化及力学性能有一定的影响[3]。NR中的蛋白质分解产物可以促进橡胶硫化,提高橡胶的定伸应力,此外蛋白质还可以提高NR的热老化等性能。蛋白质含量对天然橡乳中橡胶粒子稳定性也有一定的影响[4]。蛋白质与NR分子链间存在一定的相互作用力,通过相互作用力将不同分子链缠结到一起,蛋白质作为链间交联点形成交联网络结构。随着蛋白质的去除,橡胶粒子间交联点减少,交联结构被破坏,导致橡胶交联密度降低,交联程度降低。而随着使用温度的升高,NR中蛋白质二级结构会被破坏,因而会进一步影响NR的使用性能。但由于传统检测方法(包括:气相色谱法、液相色谱法、质谱法及核磁共振谱法)的局限性,NR中蛋白质二级结构及热变性相关研究少见报道。中红外(MIR)光谱具有方便快捷的优点,广泛应用于蛋白质二级结构研究[5-6],而变温MIR光谱[7-8]及二维MIR光谱[9]可以原位开展蛋白质二级结构的热变性研究。因此本项研究采用三级MIR光谱(包括:MIR光谱、变温MIR光谱及二维MIR光谱)分别开展NR中蛋白质二级结构及其热变性研究,为我国NR的应用及改性研究提供重要的科学参考。

1.1 原料

NR:医用止血胶管,江苏省常州市金利乳胶制品有限公司。

1.2 仪器及设备

Spectrum 100型中红外光谱仪:美国PE公司;Golden Gate型单次内反射ATR-FTIR附件、WEST 6100+型ATR-FTIR变温控件:英国Specac公司。

1.3 实验方法

红外光谱实验以大气为背景,每次对于信号进行8次扫描累加,测定频率范围4 000～600 cm-1;测温范围为293～393 K,变温步长为10 K。NR的MIR光谱数据获得采用Spectrum v 6.3.5软件;NR二维MIR光谱数据获得采用TD Version 4.2软件。

2.1 NR结构MIR光谱研究

采用一维MIR光谱开展了NR结构研究,结果见图1。

波数/cm-1(a) 一维MIR光谱

波数/cm-1(b) 二阶导数MIR光谱

波数/cm-1(c) 四阶导数MIR光谱

波数/cm-1(d) 去卷积MIR光谱图1 NR结构MIR光谱(293 K)

表1 NR结构MIR光谱数据及解释1)

2.2 NR蛋白质二级结构MIR光谱

NR蛋白质二级结构主要包括:α-螺旋结构、β-折叠结构、β-转角结构和无规则卷曲结构[12]。其中,α-螺旋结构是蛋白质结构中最普遍出现的螺旋结构;β-折叠结构是由蛋白质结构中多肽链不连续几个区域构成的;β-转角结构是蛋白质结构中最短的连接;无规则卷曲结构则是非重复性的残基构象。采用MIR光谱分别开展了NR蛋白质二级结构研究,结果见图2。

波数/cm-1(a) 一维MIR光谱

波数/cm-1(b) 二阶导数MIR光谱

波数/cm-1(c) 四阶导数MIR光谱

波数/cm-1(d) 去卷积MIR光谱图2 NR蛋白质二级结构MIR光谱(293 K)

由图2(a)可知,根据文献报道[13],NR蛋白质β-折叠及β-转角的两种二级结构对应的吸收频率分别为:1 632.70 cm-1和1 663.35 cm-1。进一步研究NR蛋白质二级结构的二阶导数MIR光谱和四阶导数MIR光谱,结果见图2(b)和(c),没有获得更多有价值光谱信息。最后研究了NR蛋白质二级结构的去卷积MIR光谱,如图2(d)所示,其中α-螺旋二级结构对应的红外吸收频率包括:1 656.00 cm-1(να-螺旋-1-去卷积)和1 653.20 cm-1(να-螺旋-2-去卷积);β-折叠二级结构对应的红外吸收频率包括:1 639.58 cm-1(νβ-折叠-1-去卷积)、1 631.99 cm-1(νβ-折叠-2-去卷积)、1 628.00 cm-1(νβ-折叠-3-去卷积)、1 624.18 cm-1(νβ-折叠-4-去卷积)和1 620.03 cm-1(νβ-折叠-5-去卷积);β-转角二级结构对应的红外吸收频率包括:1 695.11 cm-1(νβ-转角-1-去卷积)、1 687.40 cm-1(νβ-转角-2-去卷积)、1 683.84 cm-1(νβ-转角-3-去卷积)、1 673.71 cm-1(νβ-转角-4-去卷积)和1 663.46 cm-1(νβ-转角-5-去卷积)。无规则卷曲二级结构对应的红外吸收频率包括:1 649.79 cm-1(ν无规则卷曲-1-去卷积)和1 643.06 cm-1(ν无规则卷曲-2-去卷积),相关光谱数据见表2。研究发现,NR蛋白质二级结构的去卷积MIR光谱的谱图分辨能力要优于相应的一维MIR光谱、二阶导数MIR光谱及四阶导数MIR光谱。

表2 NR蛋白质二级结构MIR光谱数据及解释1)

2.3 NR蛋白质二级结构变温去卷积MIR光谱

采用变温去卷积MIR光谱,进一步开展了温度变化对于NR蛋白质二级结构影响的研究。

2.3.1 NR蛋白质无规则卷曲及β-折叠二级结构变温去卷积MIR光谱研究

采用变温去卷积MIR光谱研究温度变化对于NR蛋白质无规则卷曲及β-折叠二级结构影响的研究,结果见图3。其相关光谱数据见表3。由图3和表3可知,随着测定温度的升高,蛋白质无规则卷曲二级结构ν无规则卷曲-1-去卷积对应的吸收频率发生了明显的红移,而ν无规则卷曲-2-去卷积对应的吸收频率没有规律性的改变。ν无规则卷曲-1-去卷积对应的吸收强度略有降低,而ν无规则卷曲-2-去卷积对应的吸收强度不变。实验还发现,随着测定温度的升高,蛋白质β-折叠二级结构νβ-折叠-1-去卷积对应的吸收频率发生了明显的红移,νβ-折叠-2-去卷积、νβ-折叠-3-去卷积、νβ-折叠-4-去卷积和νβ-折叠-5-去卷积对应的吸收频率没有规律性的改变。νβ-折叠-1-去卷积、νβ-折叠-3-去卷积和νβ-折叠-5-去卷积对应的吸收强度不变,而νβ-折叠-2-去卷积和νβ-折叠-4-去卷积对应的吸收强度略有降低。

波数/cm-1图3 NR蛋白质无规则卷曲及β-折叠二级结构去卷积MIR光谱(293～393 K)

表3 NR蛋白质无规则卷曲及β-折叠二级结构变温去卷积MIR光谱数据

2.3.2 NR蛋白质α-螺旋及β-转角二级结构变温去卷积MIR光谱

采用变温去卷积MIR光谱开展温度变化对于NR蛋白质α-螺旋及β-转角二级结构影响的研究,结果见图4,相关数据见表4。

波数/cm-1图4 NR蛋白质α-螺旋及β-转角二级结构去卷积MIR光谱(293～393 K)

由图4和表4可知,随着测定温度的升高,α-螺旋二级结构να-螺旋-1-去卷积和να-螺旋-2-去卷积对应的红外吸收频率没有规律性改变,να-螺旋-1-去卷积对应的吸收强度增加,而να-螺旋-2-去卷积对应的吸收强度则进一步降低。而β-转角二级结构νβ-转角-5-去卷积对应的吸收频率发生了明显的红移,而νβ-转角-1-去卷积、νβ-转角-2-去卷积、νβ-转角-3-去卷积和νβ-转角-4-去卷积对应的吸收频率没有规律性的改变。νβ-转角-1-去卷积、νβ-转角-2-去卷积、νβ-转角-5-去卷积对应的吸收强度不变,而νβ-转角-3-去卷积、νβ-转角-4-去卷积对应的吸收强度略有增加。相关光谱数据见表4。以吸收强度作为蛋白质二级结构的相对含量的基础,研究发现,随着测定温度的升高,蛋白质β-转角二级结构含量略有增加,蛋白质β-折叠二级结构和蛋白质无规则卷曲二级结构含量略有减少,而蛋白质α-螺旋二级结构含量基本不变。

表4 NR蛋白质α-螺旋及β-转角二级结构变温去卷积MIR光谱数据

2.4 NR蛋白质二级结构二维MIR光谱

NR蛋白质二级结构同步二维MIR光谱如图5所示。

波数/cm-1(a) 平面图

(b) 立体图图5 NR蛋白质二级结构同步二维MIR光谱

由图5可知,分别在(1 650 cm-1,1 650 cm-1)和(1 665 cm-1,1 665 cm-1)频率处发现两个相对强度较大的自动峰,分别归属于蛋白质α-螺旋及β-转角二级结构。实验在(1 650 cm-1,1 665 cm-1)频率处发现一个相对强度较大的交叉峰,则进一步证明蛋白质α-螺旋及β-转角二级结构间存在着较强的分子内相互作用。进一步研究NR蛋白质二级结构异步二维MIR光谱如图6所示。

波数/cm-1(a) 平面图

(b) 立体图图6 NR蛋白质二级结构异步二维MIR光谱

由图6可知,在(1 650 cm-1,1 665 cm-1)频率处发现一个相对强度较大的自动峰。相关光谱数据及解释见表5。根据NODA原则[14-19]及表5可知,随着测定温度的升高,NR蛋白质β-转角二级结构最先改变,且变化早于α-螺旋二级结构。实验并没有发现NR蛋白质无规则卷曲及β-折叠二级结构的二维MIR光谱信息。研究[20-24]认为,热扰动因素下,NR蛋白质无规则卷曲及β-折叠二级结构则相对较为稳定。热扰动因素下,蛋白质β-转角二级结构改变则是整个NR蛋白质二级结构改变的关键步骤。

表5 NR蛋白质二级结构二维MIR光谱数据及解释

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