天然水凝胶在组织再生工程中的研究进展

黎 婷

（芜湖职业技术学院，安徽 芜湖 241000）

组织工程学基于生物学和工程学原理，利用支架、细胞和刺激物诱导新组织的生成，使用功能性生物制品重建或改善组织功能[1].相对于合成材料，天然来源支架的微分子结构具有结构和生物功能的优势，可显著促进细胞生长和细胞分化，在组织工程和再生医学中效果更好[2].天然来源支架微结构类似于组织的细胞外基质，因其保留了蛋白质和多肽-氨基酸链（如胶原蛋白和弹性蛋白）、多糖-糖链（如甲壳素、纤维素和肽聚糖）、核苷酸链（如DNA 和RNA），展现出高生物相容性、含有细胞结合位点、适合细胞黏附，其来源包括植物、动物（异种）和人[3].

基于交联机制制备的水凝胶形成的三维空间含水量丰富，具有天然组织细胞外基质的物理化学特性和生物特性，后期易于使用化学方法和生物方法（如刺激分子和生长因子）进行修饰，可增强其生物功能性[4].由于水凝胶提供的细胞生长环境优势，细胞易于黏附、生长、分化、形成组织样结构[5].近年来，为满足特殊组织需求，组织工程学制备了多种新型水凝胶.

本文中，笔者主要介绍通过多种交联机制产生的水凝胶及其作为聚合物的应用以及未来超分子化学和纳米技术的应用前景[6].

水凝胶通过物理和化学不同机制基于水环境中进行分子链交联，物理胶凝作用包括热离子胶凝、自聚、离子和静电交互，但是这些方法制备的水凝胶化学特性依赖于聚合物的固有特性，化学交联方法制备的水凝胶更易于被修饰，从而表现出良好的生物功能性[7].

在凝胶过程中，随着温度的变化，聚合链发生牵连，温度的增减会改变凝固物的溶解性，甚至会造成聚合物的凝固.物理胶凝交联机制和转变温度取决于聚合物的材质和分子量，例如明胶，哺乳动物凝胶的胶凝温度较高（25℃），淡水鱼凝胶的胶凝温度较低（10～12℃）[8].自聚取决于聚合物（范德华力、氢键和疏水键）中弱的共价键，如胶原自聚取决于分子中的脯氨酸和羟脯氨酸，易于形成胶原蛋白[9].离子和静电交互作用机制为相反电荷的相互作用，例如海藻盐胶凝机制为离子交联，由于聚合物凝固过程羧化物中二价阳离子如Ca2+的螯合作用[7].

聚合物通过共价交联形成的水凝胶具备化学活性基团，例如酶解生物化学等方法，使得水凝胶更加稳定，并且更具灵活性，在水凝胶形成过程中更易控制[7]，且没有细胞毒性影响，如过氧化物酶、转谷氨酰胺酶、酪氨酸酶等其他酶，故而近年来酶解交联制备的水凝胶由于良好的生物相容性和无致免疫性，被广泛应用于组织再生工程[10].

天然组织的去细胞外基质具有组织结构的完整性，可提供种子细胞附着和定位的黏附底物，并为种子细胞生存和分化提供足够的生物化学刺激因子.大部分去细胞外基质形成的水凝胶样结构，是基于粘多糖和蛋白多糖中多种纤维蛋白形成的结构[8].去细胞外基质的组成具有组织/器官特异性，与组织功能有直接关联，例如骨作为支撑组织，矿物质丰富，肌腱弹性纤维丰富，张力大.因此，组织特异性的去细胞外基质可诱导祖细胞/干细胞进行特异性分化，组织细胞外基质制备的水凝胶具备天然组织的生物物理学和生物化学特性[11].

2.1 蛋白质

通过细胞外基质或重组胶原、层粘连蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白及弹性蛋白制备的蛋白质，被用于制作组织再生工程中应用的仿生水凝胶和支架.大部分组织和器官干重的90%是胶原，因此，胶原是哺乳动物细胞外基质在生物材料中的应用被研究最多的蛋白.胶原在自然界动物体内分布最为广泛，胶原制备的水凝胶生物相容性，生物降解能力和细胞识别性能高，缺点是机械性能和稳定性较低，机械性能可通过化学交联（如戊二醛、甲醛和碳化二亚胺）和物理交联（如冻干或加热干燥）增强[12].

明胶是通过水解胶原制备的，便于通过不同方法和化学试剂进行修饰，例如使用甲基丙烯酰基修饰后的明胶制备的水凝胶目前被用于生物打印、光刻、微成型、自聚和微流控技术，其他方法修饰的水凝胶被用于临床治疗中再生各种组织.制备血管注射型和共价交联型明胶水凝胶，转谷氨酰胺酶通过酶促反应制备的水凝胶稳定性优越，应用于多种生物医学工程[13].

弹性蛋白是一种具有高度弹性的细胞外基质蛋白，赋予组织可复原的收缩性，由于其溶解性差，技术改良性有限，所以在组织工程应用领域使用较少.但是弹性蛋白原具有可溶性，物理化学特性与弹性蛋白相似，且易于修饰，并具有类似生长因子促有丝分裂的特性，可促进干细胞归巢和分化[14].重组和合成的弹性蛋白类似多肽显示出较好的扩展性和热属性，可用于制备生物材料，包括纳米粒子、静电纺丝超细纤维和水凝胶交联体[15].

多种聚合物可功能化赋予细胞结合蛋白功能域以制备具有生物活性的水凝胶.精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺三肽是各种细胞外基质蛋白中最小的结合功能域，可赋予聚合物细胞黏附、迁移和通路激活的功能，例如纤连蛋白序列中的精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺三肽可促进结合粘附性，调控生长因子信号通路，但是相对于天然蛋白结构，人工赋予的结合功能域，细胞黏附的紧密性和特异性较差.特异性重组纤连蛋白片段修饰的透明质酸和水凝胶，可增强调控细胞功能精确性，增强组织再生[16].

2.2 多糖

粘多糖是细胞外基质中最多的多糖种类，可与蛋白质结合形成蛋白聚糖，天然细胞外基质中的多糖对于维持组织结构和调控细胞生长和分化通路起到了关键作用.粘多糖可分为无硫酸（透明质酸）和硫酸（类肝素、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素），其多种细胞和生物功能被用作生物材料应用于组织再生工程[17].

骨和软骨中富含的硫酸软骨素是一种可生物降解的硫酸粘多糖，富含乙酰半乳糖胺和葡糖醛序列，负电荷密度高，生物医学中使用的硫酸软骨素多取自于牛和鲨鱼的气管[18].硫酸软骨素分子量小，具有阴离子特性，常用于中和阳离子聚合物（如纤维、细胞膜和纳米粒子），经过化学修饰后制备水凝胶，用于体内和体外对软骨疾病进行组织修复[19].

透明质酸是唯一一种硫酸粘多糖，由葡糖醛和乙酰氨基葡萄糖组成的二糖重复排列组成，是哺乳动物细胞外基质中重要的组成成分，从动物分离的透明质酸用于生物技术和生物医学工程，近年来生产中主要通过微生物发酵以制备透明质酸.透明质酸主要通过化学方法修饰其制备的水凝胶，用于3D 生物打印制造生物支架，可保持种子细胞的分化能力，促进软骨标志基因的表达和粘多糖沉积[20].

2.3 去细胞组织和器官

使用去细胞技术制备生物支架对全器官组织工程和体外器官模型发展具有推动作用，去细胞器官可保持完整的天然器官结构，再植入干细胞或祖细胞，其特殊的生物反应器特性可模拟该器官的特殊生理特性[21].全器官组织工程中在临床移植的应用需要突破去细胞和再细胞化的过程因素、内皮组织形成和组织特异性生物反应器的局限[22].

去细胞组织的细胞外基质通过酶促溶解、调节至生理pH 值和温度后，可被制备成生物反应器水凝胶，这样的水凝胶来源丰富，具有组织特异的生物反应器性能、结构和弹性，并具有生物相容性.一些去细胞组织的细胞外基质由于其组织物理化学和生物特性，制备的水凝胶已经用于动物移植实验体外器官/组织重构，展现出未来用于临床治疗的前景[23].

尽管如此，通过人体器官捐献或动物来源制备的去细胞组织细胞外基质，其免疫反应、不可控因素和组织/器官来源数量的有限性，成为其临床应用需要克服的局限性，目前去细胞组织细胞外基质远远达不到临床移植的标准[23].

组织工程中应用的水凝胶制备方法和生化特性日益更新，可赋予水凝胶更可控的物理化学特性，如强度更高、空间结构越准确以及更好的特质（如对温度、pH、磁场、电场或者其它刺激因子的应答性），从而创造更为精确的细胞微环境[24].静电交联方法制备的水凝胶没有细胞外基质的高活力性，这样的水凝胶没有抗压性能，植入种子细胞后的传播性、迁移性和增殖性差，需要通过水解或酶解才可能降解，但是一些其它方法制备的水凝胶缺点为机械性能差，如降解快、结构均质性低，因此需要进一步研究控制细胞对生物物理因子的回答性能[25].

水凝胶的活性表现在受体和聚合物水凝胶的主客体反应，受体大循环中的分子循环，如环糊精等，对受体疏水分子的亲和力高，因此被经常用于生物医学，天然（如透明质酸）与合成聚合物（如聚丙烯酰胺和聚乙烯乙二醇）制备的可逆超分子水凝胶与受体互补性也高[26].动态交联制备的可注射水凝胶可以直接进行细胞封装，例如改良的透明质酸水凝胶切力变稀后，可进行注射，注射位点保留度高，在小鼠心肌梗塞模型的表现出一定的治疗效果，但是透明质酸水凝胶稳定性和机械性能低，可通过超分子水凝胶交联法改进[20].例如通过己二胺结合透明质酸改良的水凝胶可进行注射，细胞相容性增强，促进人骨髓间充质干细胞的软骨发生[20].这些水凝胶性能改良研究的主要目的是增强水凝胶与受体之间的互作性能，支持生物工程改造骨髓间充质干细胞的长期存活和转基因表达，未来可应用于癌症等其它疾病的细胞治疗[27].

在组织缺陷活体动物模型中，具有生物相容性的可注射水凝胶可进行细胞移植，增强干细胞介导的血管生成和骨生成[27]，进一步验证了水凝胶在组织工程应用的前景.

组织工程掀起了人工合成功能性组织和器官替代物的新潮，近10 年来，从细胞生物学到生物材料合成，以及加工技术取得了巨大的成果.生物制造业随之产生，并伴随组织工程不断发展，产生了多种组织替代物.使用生物墨水的3D 生物打印技术，其细胞相容性成为其临床移植应用的瓶颈，新型生物聚合物材料制备的水凝胶可突破上述局限，在3D 打印中通过共价交联提高结构稳定性，在未来具有通过生物制造应用于组织再生工程的前景.

固然，组织再生工程存在个体复杂性等因素，未来随着精密制造、3D 打印和干细胞生物学等技术、生物材料的不断研究和发展，会打破传统的2D 细胞单层培养和动物疾病模型，会为特殊患者提供更多合适的治疗方法，尤其是个性化组织的构建.组织和器官的天然结构具有多层次结构、多种细胞类型和细胞外基质，以及复杂的血管、神经和淋巴管的网络，动态的微环境可满足细胞活性需求.通过基因工程获得的新型活体生物材料可不断修饰生物材料微环境，以满足个性化的临床需求，在组织再生工程中具有广泛的应用前景.

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