HPLC-ELSD测定灵芝孢子油中8个甘油三酯类成分的含量

郭 原，朱米群，钱一帆，温明皓，陆宇婷，宋 敏，杭太俊*

1南京中科药业有限公司，南京 211102；
2中国药科大学 药物分析系，南京 210009

灵芝孢子粉由多孔菌科真菌赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.]的干燥成熟孢子制得[1]。灵芝孢子油（ganoderma lucidum spore oil，GLSO）是灵芝孢子破壁后，经超临界CO2流体萃取得到的脂肪油，GLSO 主要以甘油三酯（triglycerides，TGs）形式存在，同时还含有少量游离脂肪酸和类固醇酯[2，3]，具有抗炎、抗氧化、增强免疫力、抗癌等功效[4-7]。其中，TGs 主要包括1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯（1，2-linolein-3-olein，LLO）、1，2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯（1，2-linolein-3-palmitin，LLP）、1，2-二油酸-3-亚油酸甘油酯（1，2-dioleoyl-3-linolein，OOL）、三油酸甘油酯（triolein，OOO）、1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯（1，2-olein-3-palmitin，OOP）、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯（1，2-olein-3-stearin，OOS）、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯（1-palmitin-2-olein-3-linolein，POL）、1-棕榈酸-2-油酸-3-硬脂酸甘油酯（1-palmitin-2-olein-3-stearin，POS）等[8]，脂肪酸主要有油酸、亚油酸、棕榈酸[9]等。灵芝孢子油质量标准暂未收录于各国药品标准中。《浙江省灵芝孢子粉炮制规范》[1]以乙腈-异丙醇（51∶49）为流动相，蒸发光散射检测测定灵芝孢子粉中TGs 的液相指纹图谱；
有研究[10-12]以乙腈-异丙醇为流动相（不同比例）等度洗脱，分离灵芝孢子油中的各类TGs 成分。但这些方法所需分析时间均较长（约60 min），样品分离效能低。本研究利用超高效液相色谱法（UPLC），以乙腈-无水乙醇-甲基叔丁基醚为流动相等度洗脱，显著提高了HPLC-ELSD检测灵芝孢子油中甘油三酯类成分含量的效率。

1.1 药品与试剂

灵芝孢子油软胶囊（南京中科药业股份有限公司，批号：20220418、20220802、20220902、20220928、20221008、20221018、20221125）；
对照品：LLO（批号：V067∶12）、LLP（批号：X867∶12）、OOL（批号：Y094∶2）、OOO（批号：Y479∶7）、OOP（批号：Y103∶2）、OOS（批号：X510∶9）、POL（批号：Y595∶9）、POS（批号：Y578∶9）均购自瑞典Larodan AB 公司（纯度＞99%）；
乙腈、无水乙醇、甲基叔丁基醚均为HPLC 级（德国Merck 公司）。

1.2 仪器

Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色谱柱、1260 Infinity 型高效液相仪、1260 Infinity 型蒸发光散射检测器（美国Agilent 公司）、BT25S 分析天平（德国Sartorius 公司）等。

2.1 溶液配制

取各甘油三酯对照品适量，精密称定，分别用流动相溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含2.5 mg的溶液，作为各对照品储备液。精密量取各对照品储备液适量，分别用流动相定量稀释制成每1 mL 含LLO、LLP、OOS、POS 约20 μg，OOL、POL 约50 μg，OOO、OOP 约100 μg 的各对照品溶液。

分别精密量取各对照品储备液适量置同一量瓶中，加流动相定量稀释制成每1 mL 中含LLP、POS、LLO、OOS 约50 μg，OOL、POL 约120 μg，OOO、OOP 约250 μg 的混合溶液，作为混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，加流动相定量稀释制成每1 mL 含LLP、POS、LLO、OOS 约20 μg，OOL、POL 约50 μg，OOO、OOP 约100 μg 的混合对照品溶液。

取本品内容物适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含600 μg 的溶液，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 高效液相色谱条件

以Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm ×4.6 mm，2.7 μm）为色谱柱；
以乙腈-无水乙醇-甲基叔丁基醚（45∶45∶10）为流动相，流速为0.8 mL·min-1，柱温为25℃，进样量10 μL；
蒸发光散射检测器参数为雾化器/漂移管温度70℃，氮气流速1.20 L·min-1。

2.3 专属性与色谱系统适用性试验

精密量取“2.1”项下各对照品溶液、混合对照品溶液及供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果（图1）表明以OOO 为对照，LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的相对保留时间（relative retention time，RRT）分别约为0.61、0.64、0.78、0.81、1.00、1.04、1.34、1.40，峰形对称性和分离度良好，空白溶剂对各甘油三酯测定无干扰，且各甘油三酯分离度大于1.5，理论塔板数按OOO 计算不低于3000，该方法专属性和系统适用性良好。

图1 空白溶剂（A）、定量限溶液（B）、混合对照品溶液（C）及供试品溶液（D）中甘油三酯的HPLC-ELSD 色谱图

2.4 线性和范围

分别精密量取各对照品储备液适量置同一量瓶中，加流动相定量稀释制成每1 mL 中约含各甘油三酯4、10、20、50、100、200 μg 的系列混合对照溶液。精密量取上述溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以各甘油三酯的峰面积对数（lgA）为Y，对其质量浓度对数（lgC，μg·mL-1）为X 进行线性回归。结果（表1）表明，其蒸发光散射响应均在约4.0～200 μg·mL-1浓度范围呈现良好的线性关系（r ＞0.999）。不同组分色谱响应线性回归分析的斜率均约为1.5，因此，在建立的色谱条件下，各组分的响应因子相当。在对照品不齐全的情况下，可以采用主成分为对照，外标峰面积法直接估算各组分的含量。

表1 8 种甘油三酯的校正曲线

2.5 定量限

以各成分标准曲线的浓度下限（40 μg·mL-1）为其定量限，实验测得LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的浓度分别在约为3.79、4.24、4.27、4.59、4.09、4.36、4.34、3.73 μg·mL-1的情况下，各组分的色谱响应信噪比均大于10（图1）。

2.6 溶液稳定性

取供试品溶液和50 μg·mL-1质量浓度水平混合对照溶液，在室温下分别放置约30 h，于放置不同时间点精密量取上述溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以“2.4”项下各曲线标准计算各甘油三酯浓度。结果不同时间点测得溶液中各甘油三酯的浓度结果一致（RSD 均小于2.0%），表明该供试品和对照品溶液在室温放置30 h 内均稳定（表2～3）。

表2 甘油三酯混合对照品溶液稳定性（μg·mL-1）

表3 灵芝孢子油供试品溶液稳定性（μg·mL-1）

2.7 加样回收率试验

本底溶液：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含300 μg 的溶液，过滤，取续滤液。

加样回收率试验溶液：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释成储备液，精密量取适量，置10 mL 量瓶中，分别精密加入“2.1”项下混合对照品储备液1.0、2.0 或3.0 mL，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为低（50%）、中（100%）、高（150%）浓度的溶液。低、高浓度各3 份，中浓度6 份。

精密量取上述溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按标准曲线法计算各甘油三酯的浓度，扣除样品中的本底浓度，即得各甘油三酯对照品浓度，与加入浓度相比分别计算加样回收率。结果表明，LLO、LLP、OOL、POL、OOO、OOP、OOS、POS 的平均加样回收率均在96.63%～107.53%，RSD 均小于5.0%。根据《中华人民共和国药典》（2020 年版）通则9101[13]中回收率限度的规定，本品属于基质复杂及多成分范畴，同时采用了检测响应灵敏度相对较低的蒸发光散射检测器，回收率限度可适当放宽，故本法准确度良好。

2.8 进样精密度

取“2.1”项下混合对照品溶液，照“2.2”项下条件连续进样6 次，记录色谱图。结果表明，各成分保留时间的RSD 均小于1.0%；
浓度的RSD 分别为0.55%、1.71%、0.52%、0.33%、0.48%、0.25%、0.55%和1.09%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.9 重复性

取“2.7”项下中浓度（100%）试验溶液6 份，照“2.2”项下方法进行测定。按标准曲线法计算各甘油三酯的浓度，扣除样品中的本底浓度，即得各甘油三酯对照品浓度，与加入浓度相比分别计算加样回收率。

结果表明，各甘油三酯的平均加样回收率为96.32%～106.01%（RSD ＜2.0%）范围。根据《中华人民共和国药典》（2020 年版）通则9101[13]中精密度可接受范围的规定，本品属于基质复杂及多成分范畴，同时采用了检测响应灵敏度相对较低的ELSD检测器，重复性RSD 范围可适当放宽。故本法重复性良好（表4）。

表4 灵芝孢子油中甘油三酯重复性试验结果

2.10 样品测定

精密量取“2.1”项下供试品溶液及“2.5”项下系列混合对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以各甘油三酯的峰面积对数（lgA）为Y，对其质量浓度对数（lgC，μg·mL-1）为X 进行线性回归，按标准曲线法计算各甘油三酯的含量。

结果（表5）表明，不同批次的灵芝孢子油中的甘油三酯总量相对均一，但各甘油三酯成分的含量，由于受药材的产地或采收时期等因素影响而有所差异，其中相对含量较低的OOS（RSD 8.23%）和LLP（RSD 9.95%）含量波动略显著。

表5 灵芝孢子油中甘油三酯含量测定结果（mg·g-1）

本研究在非水反相色谱（nonaqueous reverse phase chromatography，NARP）流动相体系中加入甲基叔丁基醚，利用其强洗脱性，显著加快样品洗脱速度，同时以Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm)为色谱柱，相比于常规ODS 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）填料粒径更小，有利于降低涡流扩散及改变传质路径，提高柱效，并有效地缩短分析时间和减少溶剂消耗，更加绿色环保[14，15]。

本研究建立了一种灵芝孢子油中8 个甘油三酯类成分含量的HPLC-ELSD 法，具有专属性好、分析洗脱时间适宜、定量准确等优点，满足了灵芝孢子油中甘油三酯类成分质量控制的要求，也可适用于其他植物油脂中甘油三酯的测定。

在建立的ELSD 为检测器的色谱条件下，不同甘油三酯类成分的响应因子相当。在对照品不齐全的情况下，可以采用主成分为对照的外标峰面积法直接估算各组分的含量。

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