白首乌对干燥综合征模型小鼠影响的实验研究

张霞，雷紫琴，秦甜甜，祁琥，曾南

白首乌为萝藦科(Asclepiadaceae)鹅绒藤属(CynanchumLinn. )植物，是耳叶牛皮消(Cynanchum auriculatumRoyle ex Wight.)、隔山牛皮消(Cynanchumwilfordii Hemsl.)和戟叶牛皮消(Cynanchum bungeiDecne.)的块根[1]。该药材具有补肝肾、益精血、强筋骨、健脾消食、解毒疗疮功效[2]，用于肝肾阴虚所致头昏眼花、腰膝酸软、须白、体虚多梦、失眠健忘、皮肤瘙痒等多种疾病[3]。现代研究发现白首乌化学成分丰富，其中最重要的有C21甾体苷类、多糖类、苯酮类等活性成分，与白首乌的多种药理活性密切相关[4]。

干燥综合征(Sjögren’s syndrome, SS)是外分泌腺的一种慢性自身免疫性疾病，以唾液腺和泪腺的高度淋巴细胞浸润为特征[5,6]。临床常见眼睛干燥、口腔干燥，且常引起与外分泌腺相连的其他表皮干燥，严重时可引起脏器功能受损[7]。SS近年来发病率持续升高，因发病机制复杂，临床治疗多依赖于糖皮质激素、免疫抑制剂等全身免疫调节药物治疗，但治疗疗效只限定于活动期的系统受累的干燥综合征患者，且用药引起的副作用令人担忧[8]。传统中医药在缓解干燥综合征患者口眼干燥及其他临床症状时，与西药治疗相比，被发现其作用范围较广，且临床与动物实验研究表明中药对SS患者口、眼干燥的临床症状和SS小鼠的唾液分泌量、颌下腺损伤指数以及局部免疫炎症微环境有明显的改善作用，尤其是轻型干燥综合征患者，可采用单纯中药治疗[9,10]。本实验基于前期研究基础[11]，采用同种小鼠自身抗原诱导造模的方法建立SS小鼠模型，观察白首乌对SS小鼠颌下腺功能障碍的影响及其影响CHRM3的作用机制，为白首乌用于SS的治疗及今后的深入研究提供初步的药理学依据。

1.1 实验药物

白首乌饮片（Cynanchum auriculatumRoyle ex Wight.，批号：20200715）由泸州品创科技有限公司提供，并由成都中医药大学药学院严铸云教授鉴定。硫酸羟氯喹（批号：210360，上海上药中西制药有限公司）

1.2 实验动物

雌性C57BL/6小鼠（6周龄，20±2 g）购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK（北京）2019-0010。动物在成都中医药大学药学院动物观察室饲养，许可证号SYXK（四川）2020-124。给药前适应性喂养5天，恒温25±1℃、相对湿度40%～60%、12 h光暗交替，自由进食、饮水。所有动物研究均按照成都中医药大学药学院实验动物护理和使用委员会的指南（编号20200320）进行。

1.3 实验试剂

动物组织总RNA提取试剂盒（Cat: RE-03014成都福际生物技术有限公司），FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂（Cat: KR118-02，天根生化科技（北京）有限公司），SuperReal荧光定量预混试剂增强版（Cat: FP205-02，天根生化科技（北京）有限公司），RIPA裂解液（Cat: P00138，上海碧云天生物技术有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（Cat: P0012，上海碧云天生物技术有限公司），CHRM3（Cat: bs-1289R，北京博奥森生物技术有限公司），β-actin Rabbit mAb（Cat:AF7018，Affinity Antibody公司），HRP-羊抗兔IgG（Cat: BM3894，武汉博士德生物工程有限公司），UltraSignal 超敏ECL化学发光底物（Cat: 4AW011-100，北京四正柏生物科技有限公司），抗SSA抗体ELISA试剂盒(Cat: JM-12306M1, 江苏晶美生物科技有限公司) ，抗SSB抗体ELISA试剂盒(Cat: JM-12312M1, 江苏晶美生物科技有限公司)。

1.4 仪器与设备

Nanodrop 2000分光光度计（赛默飞世尔科技（中国）有限公司），3001型高级多功能酶标仪、ST16R 低温高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司)，KZ-II 高效组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司），Bio-Rad ChemiDoc XRS+化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.5 方法

1.5.1 白首乌醇提物的制备 白首乌饮片与75%乙醇以料液比1:10的比例采用加热回流法回流提取2 h，减压抽滤后残渣用相同的方法再提取2次，合并3次提取液，真空浓缩，收集，冷冻干燥后备用。

1.5.2 小鼠干燥综合征（SS）模型的建立 抗原制备：低温条件下，无菌取出同种小鼠两侧颌下腺，剔除包膜、结缔组织及淋巴结等附着物，剪碎，按20 mg腺体组织加入0.2 mL生理盐水的比例制备颌下腺组织匀浆，4℃低温离心机中以3000 r·min-1速度离心15 min，将上层脂质吸除，余下上清液作为抗原备用。BCA法测定蛋白含量，PBS缓冲液将上述制备抗原稀释到蛋白浓度为5.0 mg·mL-1，加入同体积弗氏完全佐剂，调配成蛋白浓度为2.5 mg·mL-1的注射用抗原。

采用制备好的抗原随机在小鼠背部多点注射，每只小鼠注射总量为0.1 mL，并在初次免疫后的第3、7天分别用相同剂量和浓度的免疫原足垫以及背部皮下多点注射以加强免疫；
第14、21天，用不完全弗氏佐剂将颌下腺抗原调整蛋白浓度为2.5 mg·mL-1，以同样方式注射小鼠。正常组小鼠背部随机多点注射等体积生理盐水。

1.5.3 分组及给药 72只SPF级C57BL/6雌性小鼠按体重分层随机分成6组，每组12只，即空白组，模型组，白首乌醇提物低、中、高剂量组（0.4、0.8、1.6 g·kg-1）[12]和羟氯喹组（0.03 g·kg-1）。首次免疫当天小鼠开始给药，空白组和模型组给予等量生理盐水。造模周期为60天。

1.5.4 唾液分泌量与饮水量测定 小鼠饲养过程中每隔3天称量小鼠体重并按体重的变化重新计算灌胃剂量，每天定时称重每笼小鼠剩余水量。并分别在第0天（造模前）、第30天、第60天测量各组小鼠唾液分泌量，检测方法：将已称量过初始重量的干棉球放入小鼠的颊部采集唾液，3分钟后取出放置分析天平上称重，即小鼠唾液分泌量(mg)=棉球湿重(mg)-棉球干重(mg)。

1.5.5 自身抗体测定 取各组小鼠血液样品于室温静置2 h，以3500 rpm离心15 min，分离血清于一次性EP管中，置于-20℃冰箱中保存备用。ELISA法检测血清中抗SSA和抗SSB抗体水平。

1.5.6 免疫组化、 Western Blot检测颌下腺CHRM3的表达量 无菌条件下剖取颌下腺，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片；
脱蜡，浸洗，抗原修复，内源性过氧化物酶阻断，血清封闭；
兔抗CHRM3按1:200稀释，然后4℃孵育过夜；
酶标二抗37℃孵育30 min；
加DAB显色液，复染细胞核，脱水，封片；
显微镜镜检，图像采集分析。

将各组小鼠颌下腺组织样品切碎，用含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的裂解液匀浆，然后用BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白质浓度。调节各样本总蛋白至等浓度，经电泳、转膜后，一抗（1:5000）孵育过夜，二抗（1:5000）中孵育反应1.5 h，β-actin作为内参。最后，使用ChemiDocTM成像系统显影。

1.5.7 RT-PCR测定CHRM3 mRNA表达水平 根据说明书要求，收集小鼠颌下腺组织并使用动物总RNA分离试剂盒提取总RNA。然后，检测总RNA浓度和纯度，并使用FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒将其逆转录成cDNA，以β-actin为内参进行实时荧光定量聚合酶链式反应，引物序列见表1，2-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.5.8 统计分析 原始记录由纸质书写和计算机系统同时记录。采用统计软件SPSS 23.0进行实验数据统计，以±s表示，计量数据符合正态性分布的采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或t检验，不符合正态者则采用非参数检验法分析，各组所得数据均与模型组比较，P＜0.05为两组之间存在统计学差异。

2.1 白首乌醇提物对SS模型小鼠饮水量和唾液分泌量的影响

造模之后，小鼠的日均饮水量和唾液分泌量均发生明显变化。如图1所示，与模型组比较，白首乌醇提物各剂量组和羟氯喹组小鼠日均饮水量明显降低。如图2所示，分别在第0天（造模前）、第30天、第60天测量各组小鼠唾液分泌量，从的结果来看，各给药组小鼠唾液分泌量在第30、60天均显著高于模型组（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

图1 白首乌对SS模型小鼠日均饮水量的影响

图2 白首乌对SS模型小鼠唾液分泌量的影响

2.2 白首乌醇提物对SS模型小鼠自身抗体水平的影响

结果表明，与空白组比较，模型组小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗体水平均显著升高（P＜0.001），提示造模成功。与模型组比较，白首乌醇提物各剂量组和羟氯喹组小鼠血清中抗SSA与抗SSB抗体水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），提示药物对模型具有对抗作用。见表2、图3。

图3 白首乌对SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗体水平的影响

表2 白首乌对SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗体水平的影响(±s)

表2 白首乌对SS模型小鼠血清中抗SSA和抗SSB抗体水平的影响(±s)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

抗SSB抗体（ng·mL-1）空白组——283.75±20.93*** 144.24±8.59***模型组——370.89±16.29193.14±19.41白首乌醇提物0.4339.83±9.92*163.43±6.86**白首乌醇提物0.8294.72±12.44*** 149.12±8.82***白首乌醇提物1.6270.47±3.50*** 143.72±7.89***羟氯喹组0.03277.87±25.76*** 154.72±11.96**组别剂量（g·kg-1）抗SSA抗体（ng·mL-1）

2.3 白首乌醇提物对SS模型小鼠颌下腺CHRM3表达的影响

I H C 结果显示，模型组小鼠颌下腺组织中CHRM3阳性表达较空白组显著减弱（P＜0.05），而白首乌醇提物各剂量组和羟氯喹组小鼠颌下腺组织中CHRM3阳性表达较模型组显著增强（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），见图4。

图4 白首乌对SS模型小鼠颌下腺组织CHRM3阳性表达的影响（IHC法）

如图5所示，模型组小鼠颌下腺组织中CHRM3蛋白表达量较空白组显著降低（P＜0.001）；
与模型组比较，白首乌醇提物高剂量组和羟氯喹组小鼠颌下腺组织中CHRM3蛋白表达量显著升高（P＜0.001，P＜0.05）。

图5 白首乌对SS模型小鼠颌下腺组织中CHRM3蛋白表达量的影响（WB法）

2.4 白首乌醇提物对SS模型小鼠颌下腺CHRM3 mRNA表达的影响

PCR实验结果显示，与空白组比较，模型组小鼠颌下腺组织中CHRM3 mRNA表达水平显著降低（P＜0.001）；
与模型组比较，白首乌醇提物高剂量组小鼠颌下腺组织中CHRM3 mRNA表达水平显著上调（P＜0.001）。见表3、图6。

表3 白首乌对SS模型小鼠颌下腺组织CHRM3 mRNA相对表达水平的影响(±s)

注：与模型组比较， ***P＜0.001

组别剂量（g·kg-1）△CT空白组——1.00±0.00***模型组——0.08±0.01白首乌醇提物1.61.20±0.25***羟氯喹组0.030.08±0.03

典型的SS临床表现是以外分泌腺淋巴细胞浸润为特征的口干眼干，在疾病进展期间，患者可能出现其他一些临床病变，如关节炎、疲劳、皮肤血管炎、肺间质疾病、周围神经和中枢神经病变、肾衰竭、胃肠道疾病等[13]。研究认为，抗SSA和抗SSB抗体均是诊断该病的特异性抗体，SS患者体内抗SSA抗体、抗SSB抗体的阳性率更高[14,15]。本实验研究观察到SS模型小鼠血清中抗SSA抗体、抗SSB抗体水平，与空白组比较均显著升高，提示模型的成功建立，而白首乌醇提物各剂量组和羟氯喹组小鼠血清中两种抗体水平较模型组显著降低，表明药物能改善模型小鼠免疫功能的异常。此外，饮水量及唾液分泌量是反映唾液腺功能的客观指标，实验发现，造模前各组小鼠饮水量和唾液分泌量均无统计学差异，造模后可见模型组小鼠饮水量较空白组显著增加，唾液分泌量则显著减少，表明SS模型小鼠唾液腺分泌功能较正常小鼠明显减弱，进一步提示模型的成功建立。亦可发现，随着疾病的进展SS模型小鼠饮水量逐渐增多，唾液分泌量则逐渐下降，而白首乌醇提物同步给药防治后能有效控制饮水量的增加，并增强唾液分泌能力，对唾液腺的功能有一定保护作用。

在基本明确了白首乌对SS模型小鼠的改善作用后，本实验采用免疫组化、RT-PCR、Western Blot法观察了白首乌醇提物对SS模型小鼠颌下腺组织毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3（Muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3）表达的影响，以期初步揭示其作用机制。毒蕈碱型乙酰胆碱受体M，是一种单链跨膜糖蛋白，在体内主要参与肌肉收缩调节、呼吸、运动、体温调节、学习、记忆等重要生理功能[16]。CHRM3为该家族成员之一，主要分布在唾液腺和泪腺等外分泌腺，通过副交感神经调节影响外分泌腺体的分泌功能，即在腺体分泌中起关键作用[17]。研究证实，CHRM3参与SS的发病，抗CHRM3抗体的存在与SS患者分泌功能障碍具有直接关联性[18]，SS患者自身产生抗CHRM3抗体，可能诱导CHRM3异位表达于导管，引起颌下腺受损血流反应和唾液输出量减少[19]，阻断乙酰胆碱对M3受体的激活，能干扰乙酰胆碱能神经信号的有效传递，损伤颌下腺、减少唾液分泌量；
并可激活磷脂酶C信号传导通路，增加腺体局部NO水平，破坏涎腺组织结构，导致唾液、泪液分泌减少，从而引起口干眼干等SS症状[20,21]。本实验结果显示，模型组小鼠颌下腺组织CHRM3 的mRNA、蛋白表达水平均显著下调，提示SS小鼠颌下腺功能出现障碍，白首乌醇提物能上调CHRM3 mRNA和蛋白表达，表明白首乌能通过影响CHRM3的基因与蛋白表达，发挥对SS小鼠颌下腺功能改善的作用。

综上，本研究结果表明白首乌醇提物对SS模型小鼠具有干预作用，下调特征性抗体水平，改善唾液腺分泌功能，有效缓解SS症状，作用机制与上调CHRM3功能有关。此外，白首乌作为一种提高机体免疫功能的药材，而SS的发病机制与机体免疫功能紊乱有关，因此今后研究中可从影响免疫功能角度开展其干预SS的作用。

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