麦蛾柔茧蜂幼虫唾液腺的显微与超微形态观察

高星雨,俞凯丽,方 琦,汪 芳,姚洪渭,叶恭银

(浙江大学昆虫科学研究所,水稻生物学国家重点实验室,农业农村部作物病虫害分子生物学重点实验室,杭州 310058)

昆虫唾液腺作为一类典型的多细胞外分泌腺,由外胚层细胞内陷形成,是昆虫消化系统的重要组成部分,也是重要的生物学和遗传学研究材料(黄志君等,2007)。昆虫唾液腺合成并分泌唾液。唾液作为昆虫与植物、昆虫与动物之间的媒介物质,具有诸如消化食物(Eberhardetal.,2007;Harpeletal.,2015)、规避动植物宿主防御(Baxteretal.,2014)、调控个体系统性生长(Lietal.,2022)和协助传播病毒(Sunetal.,2020)等重要功能。目前关于昆虫唾液的研究主要以植食性昆虫和吸血性昆虫为主,而有关寄生蜂唾液腺及其唾液的研究则相对较少,仅限于粘虫稀网姬小蜂Euplectrusseparate(Nakamatsu and Tanaka,2003)、川硬皮肿腿蜂Sclerodermasichuanensis(蒋学建等,2005)和蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum(任朝都,2021)等。

麦蛾柔茧蜂HabrobraconhebetorSay属膜翅目Hymenoptera茧蜂科Braconidae,营外寄生。该蜂寄主范围广,是农业生产与仓储中鳞翅目害虫的重要优势天敌,已成功用于多种害虫的生物防控(黄信飞,1986;阿克旦等,2006;Baetal.,2013;郭超等,2021)。麦蛾柔茧蜂寄生后,孵化的幼虫在寄主害虫体表通过取食寄主血淋巴获得营养,其中唾液在食物消化和寄主免疫调控等过程中发挥着重要作用(金虹霞,2020)。但是,有关该蜂唾液腺形态结构尚不清楚。为此,本文对麦蛾柔茧蜂唾液腺显微与超微形态进行观察,旨在为深入研究麦蛾柔茧蜂的唾液组分及其功能、以及该蜂与其寄主间互作机制奠定基础。

1.1 供试昆虫

麦蛾柔茧蜂系在人工气候室内长期续代饲养的实验室种群。饲养条件为温度28±1℃,相对湿度75%±5%,光周期为L∶D=14 h∶10 h。寄主印度谷螟Plodiainterpunctella的饲养方法参照Phillips and Strand(1994)。

麦蛾柔茧蜂羽化成虫供以20%蜂蜜水饲喂2～3 d,同时雌雄混合充分交配。寄生时,挑取健康的4～5龄印度谷螟幼虫于透气有盖饲养盒中,按1∶10(寄生蜂:寄主)比例接入交配后的麦蛾柔茧蜂雌蜂。寄生48 h后,将雌蜂取出,并继续饲养被寄生的印度谷螟幼虫。再于10～11 d后麦蛾柔茧蜂开始化蛹,收集蜂蛹于指形管中,待其羽化。

1.2 形态观察与测量

寄生48 h以后,参照Pezzini等(2017)的区分龄期法分别取1～4龄幼蜂各15头,解剖各龄幼蜂,取其唾液腺,并采用VHX-2000超景深三维显微系统(美国基恩士公司)拍照,并测量唾液腺管道长度(从前端至末端分段累计测量)、幼虫体长和体宽。

1.3 透射电镜观察

1.3.1样品制备

将解剖的唾液腺浸没于2.5%戊二醛溶液中进行固定,4℃过夜,后移除戊二醛,加入5%琼脂糖溶液,待冷却凝固后切去多余琼脂块。用0.1M pH7.0磷酸缓冲液漂洗样品3次,每次15 min。加入1%四氧化锇溶液浸没样品,再次固定1～2 h,后移除溶液,用0.1M pH7.0磷酸缓冲液漂洗样品3次,每次15 min。样品依次经30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%梯度浓度的乙醇溶液和纯丙酮进行脱水处理,每个浓度处理样品20 min后,再依次用Spurr包埋剂与丙酮的混合溶液I(1∶1,v/v)和混合溶液II(31,v/v)分别处理样品1 h和3 h,后用纯包埋剂处理,室温过夜,进行渗透。将渗透处理后的样品进行包埋,70℃过夜。

1.3.2结构观察

样品在LEICA EM UC7型冷冻超薄切片机(德国徕卡公司)中切片,获得厚度70～90 nm的切片,切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5～10 min,在Hitachi H-7650型透射电镜(日本日立公司)80 kV条件下观察并拍照。

1.4 数据统计分析

麦蛾柔茧蜂幼虫各龄虫体大小以及唾液腺管长等测量重复6次以上。形态数据的统计分析使用DPS数据处理系统(Tang and Zhang,2013),两个平均数之间比较的差异显著性分析采用t测验,多个平均数之间比较的差异显著性分析采用单因素方差分析和LSD检验法。

2.1 唾液腺形态

麦蛾柔茧蜂幼虫的唾液腺为一对管状腺体,色透明至乳白色,呈弯曲折叠状(图1)。唾液腺从口腔沿中肠两侧向后延伸,包埋于大量脂肪体中。根据唾液腺的形态,可分成三部分:(1)与口腔连接的前部;(2)成环状的中部;(3)延伸至虫体尾部的后部。前部腺体管长相对较短,一对腺体在腺管顶端汇合后开口于幼蜂口腔内;中部腺体管道弯曲折叠形成不规则环状,腺管外附着较多脂肪体;后部末端闭合成盲管,较尖。

图1 麦蛾柔茧蜂4龄幼虫唾液腺的显微形态

2.2 唾液腺生长发育

麦蛾柔茧蜂唾液腺均随幼虫的生长发育呈线性增长,且不同龄期单侧唾液腺的管道长度之间呈极显著差异(F=85.06, df=3,32,P<0.01)(图2)。单侧唾液腺管道均极显著长于相同龄期幼虫的体长和体宽(1龄:F=398.89, df=2,12,P<0.01;2龄:F=124.56, df=2,27,P<0.01;3龄:F=330.96, df=2,27,P<0.01;4龄:F=391.63, df=2,30,P<0.01)。相对于麦蛾柔茧蜂幼虫体长变化,单侧腺管长度的变化较为平缓,但不同龄期的比值差异仍达极显著(F=45.56, df=3,32,P<0.01);相对于幼虫体宽变化,单侧腺管长度比值随幼虫生长呈下降趋势,后随龄期增长而比值变化趋于平缓,且不同龄期间的差异达极显著(F=117.63, df=3,32,P<0.01)。这表明该幼虫唾液腺的增长速率在幼虫高龄阶段已明显低于虫体的增长速率。

图2 麦蛾柔茧蜂不同龄期幼虫唾液腺大小的变化

2.3 唾液腺超微结构

麦蛾柔茧蜂幼虫唾液腺呈中空管道结构,管道由单层细胞构成(图3-A),且其细胞核形状多呈不规则状,核内物质不规则分散,染色质浓密(图3-B)。根据细胞形态结构,可大致为两类细胞:I型细胞和II型细胞。I型细胞富含线粒体和内质网和囊泡(图3-C,D),微绒毛长而致密(图3-C),不仅有较多糖原分布,而且在囊泡中存在运输的分泌颗粒(图3-E),部分I型细胞中能观察到脂滴(3-F)。

图3 麦蛾柔茧蜂幼虫唾液腺I型细胞的超微结构

II型细胞呈单层(图4-A),微绒毛短而疏(图4-B),胞内虽含大量的内质网和线粒体等细胞器(图4-C),亦可见有糖原分布(图4-D),但少见有囊泡分布。

图4 麦蛾柔茧蜂幼虫唾液腺II型细胞的超微结构

昆虫唾液腺的形态结构和功能因种类不同而极具多样性(黄志君等,2007)。麦蛾柔茧蜂幼虫的唾液腺呈管腔状,单侧腺体在中部先分支、后合并成一不规则环状,端部尖且呈单盲管状。这与现有报道的其他昆虫唾液腺如半翅目捕食性蝽Brontocoristabidus由导管连接前后肺叶状主腺和管状副腺组成(Carvalhoetal.,2021)、双翅目吸血蠓由葡萄腺泡状主腺和突起状副腺组成(甯媛,2021)、鳞翅目蛱蝶简单管状腺体(Eberhard and Krenn,2003)和膜翅目意大利工蜂Apismellifera由扁平梨状头腺和管状胸腺组成(Schönitzer and Seifert,1990;Poiani and Cruz-Landim,2009)等形态结构明显不同,且与已报道的寄生蜂唾液腺如粘虫稀网姬小蜂幼虫的长梭状(Nakamatsu and Tanaka,2003)、川硬皮肿腿蜂幼虫的管状和成虫的袋状(蒋学建等,2005)以及蝶蛹金小蜂幼虫的长柄葫芦状(任朝都,2021)等形态差异较大,推测可能与所属类群以及生活习性等差异较大有关。麦蛾柔茧蜂幼虫唾液腺的位置分布和腺管被脂肪体包裹等特征却与韭菜迟眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga(宋建等,2004;高欢欢等,2015)和家蚕Bombyxmori(Zhangetal., 2006)的较为相似。

麦蛾柔茧蜂幼虫唾液腺管壁由单层细胞构成。唾液腺细胞似有两类细胞组成,其差异在于胞内是否含有大量囊泡。I型细胞具有大量囊泡,与粘虫稀网姬小蜂(Nakamatsu and Tanaka,2003)唾液腺中观察到的具有大量粗面内质网和囊泡的细胞相似,推测I型细胞主要参与胞内物质合成与分泌有关。此外,还观察到了囊泡运输分泌颗粒现象。麦蛾柔茧蜂唾液腺胞内分泌颗粒密度较小,与蝶蛹金小蜂(任朝都,2021)和锥形禾草铲头沫蝉Cloviaconifera(钟海英,2011)等唾液腺胞内电子密度较大的分泌颗粒存在明显差异。这可能和不同昆虫种类唾液腺的分泌物质不同有关。麦蛾柔茧蜂唾液腺中的II型细胞明显缺少胞内囊泡,而且微绒毛短而稀疏,推测主要参与细胞增殖与滋养。有关麦蛾柔茧蜂唾液腺的结构和唾液合成与分泌功能的相互适应机制、唾液的组成及其与寄主间的互作机制有待今后进一步深入研究。

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