基于网络药理学与分子对接探讨苓桂术甘汤治疗新冠肺炎合并支气管哮喘潜在作用机制研究

王昱丹，李正祎，杨凯丽，初梦瑶，韩路生，陈长宝，李 光，王恩鹏*（.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，长春 307；
.吉林医药学院检验学院，吉林 吉林 303；
3.长春中医药大学药学院，长春 307）

支气管哮喘是一种以气道慢性高反应性炎症为主要特征的呼吸系统疾病，以咳嗽、胸闷、气促为主要临床症状，其发病机制复杂，至今没有得到合理的解释[1]。全球范围内支气管哮喘发病率逐年上升，给社会以及家庭带来严重医疗经济负担，很难完全被治愈。西医治疗长期服用激素以控制哮喘，其不良反应明显，症状反复。中医基础理论中，支气管哮喘被称为“哮症”[2]，认为因痰气交阻、闭塞气道、肺的升降失职所致。2022 版全球哮喘管理和预防策略指出，哮喘患者对新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的感染风险并未增加[3]，但研究发现患有严重哮喘在新冠疫情期间住院风险增加[4]。患者新冠疫情大流行期间，支气管哮喘患者高感知压力患病率为10.6%，创伤后压力风险11.3%，抑郁风险31.5%，失眠风险57.7%[5]，已严重造成患者心理压力。

苓桂术甘汤是我国历史悠久的经典名方，出自汉代张仲景撰《金匮要略》[6]，为国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》[7]。此方可治疗痰饮疾病，上温心阳、下利水湿、中健脾土。苓桂术甘汤作为中药复方在治疗疾病中具有多靶点、多途径、多方向等特点，在临床诊疗中取得显著成效[8]。

但目前仍少有文献报道苓桂术甘汤对于新冠肺炎合并支气管哮喘防治的作用机制，故本研究应用网络药理学方法，通过构建苓桂术甘汤有效活性成分-关键靶点-新冠肺炎合并支气管哮喘疾病的多层次生物网络，结合GO 富集分析和代谢途径分析数据库（KEGG）进行通路富集分析[9]，并用分子对接更好地补充验证，为今后开创和研究奠定基础。

1.1 数据库

数据库应用平台：TCMSP 中药系统药理学数据库与分析平台（https：∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）；
UnipProt 数据库（https：∥www.uniprot.org/）；
OMIM 人类孟德尔遗传数据库https：∥www.omim.org/）；
Genecards 人类基因综合数据库（https：∥www.genecards.org/）；
TTD 药物靶点数据库（https：∥db.idrblab.net/ttd/）；
DisGeNET（https：∥www.disgenet.org/）；
String 数据库（https：∥cn.string-db.org/）；
Metascape 数据库（https：∥metascape.org/）；
微生信（https：∥www.bioinformatics.com.cn/）；
PDB 数据库（https：∥www.rcsb.org/）；
Cytoscape软件（3.7.1）；
Autodock1.5.7。

1.2 苓桂术甘汤活性成分的收集

利用TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台收集苓桂术甘汤化合物，以茯苓、桂枝、白术、甘草为关键词收集相关有效成分及相关靶点，筛选条件为生物口服利用度OB≥30%同时满足类药性DL 值≥0.18[10]。

1.3 苓桂术甘汤靶点收集

将收集的有效成分相关靶点应用Uniprot数据库进行匹配筛选标准化基因命名。

1.4 疾病基因收集

以“bronchial asthma”和“COVID-19”为关键词分别在OMIM 人类孟德尔遗传数据库、Genecards 人类基因综合数据库、TTD药物靶点数据库、DisGeNET数据库获得新冠肺炎和支气管哮喘相关靶点及基因。

1.5 苓桂术甘汤与支气管哮喘疾病共同靶点收集

将苓桂术甘汤和新冠肺炎合并支气管哮喘疾病相关基因利用韦恩图筛选共同基因靶点。

1.6 苓桂术甘汤与支气管哮喘相互作用网络分析

将化合物—疾病交集靶点提交到String 数据库，限定物种为“人”（Homo sapiens），获得靶点网络互作分析。

1.7 富集分析

将苓桂术甘汤-新冠肺炎合并支气管哮喘靶点提交到Metascape 数据库进行细胞组成（cellular component，CC）、生物学过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）的GO 富集分析和KEGG 通路分析。利用微生信平台下载分析包，选取排名前10的进行GO富集分析和KEGG通路分析。

1.8 分子对接

利用分子对接技术，将网络药理筛选的活性成分和重要靶点的相互作用进行预测与验证。从Pub-Chem 数据库下载有效活性成分的分子结构型，从PDB数据库下载核心蛋白结构域。运用PyMOL 软件对蛋白质分子进行去水、加氢等操作。运用AutoDockTools 1.5.7 软件将苓桂术甘汤活性成分及核心蛋白基因文件pdb 格式转换为pdbqt 格式，使用软件内盒子对接，将分子结构与蛋白质结构包裹进行对接，选择合适的最佳对接位点。

2.1 苓桂术甘汤治疗支气管哮喘靶点预测

通过TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台收集苓桂术甘汤中同时满足口服利用度OB≥30%和类药性DL 值≥0.18的药物有效活性成分共121个，其中茯苓15 个、桂枝7 个、白术7 个、甘草92 个，结果见表1。通过Genecards、OMIM、TTD、DisgeNET 数据库获取支气管哮喘靶点共2115 个，新冠肺炎靶点1972个。将上述靶点互相匹配，共获得58 个苓桂术甘汤治疗支气管哮喘潜在交集靶点，具体为：AR、DPP4、ADIPOQ、GSTM1、IKBKB、NFKBIA、NOS2、IL1B、RXRB、RAF1、SERPINE1、BAX、XDH、TNF、CHUK、IRF1、TGFB1、F10、MMP1、MMP3、F3、IL1A、AHR、CD40LG、CRP、ALOX5、MAPK1、ICAM1、IL10、CXCL2、IL6、HMOX1、CYP3A4、AKT1、RELA、NFE2L2、CCL2、EGFR、PLAU、VEGFA、SIRT1、CAT、MPO、THBD、BCL2、NOS3、SPP1、CXCL10、PON1、IL4、STAT1、STAT3、HIF1A、IFNG、HMGCR、PLAT、IL2、CXCL8，结果用图1表示。

表1 苓桂术甘汤有效活性成分成分Tab.1 Active ingredients of Linggui Zhugan Decoction

图1 苓桂术甘汤与支气管哮喘疾病交集靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of the intersection target of Linggui Zhuga Decoction and bronchial asthma disease

2.2 苓桂术甘汤成分靶点-支气管哮喘疾病靶点网络

首先将筛选的58 个交集靶点导入STRING 数据库中，物种限定为“Homo sapiens”，得到潜在作用靶点的PPI网络保存其TSV 格式文件。将信息导入Cytoscape 软件作图。每个靶点与其他靶点相连线段数量越多degree 值越大则说明该点越重要。通过degree 值比较筛选出10 个degree 值最高的靶点作为核心靶点。分别是TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、CXCL8、STAT3、CCL2、ICAM1、IL10。排名前10 的靶点Degree值见表2。PPI网络图见图2。

表2 苓桂术甘汤治疗支气管哮喘关键靶点拓扑学参数表Tab.2 Topological parameters of the key targets of Linggui Zhugan Decoction in the treatment of bronchial asthma

图2 苓桂术甘汤蛋白网络互作图（PPI图）Fig.2 Protein network interaction diagram of Linggui Zhugan Decoction（PPI diagram）

2.3 GO富集分析

在Metascape 基因富集分析网站中整理药物靶点，在智人数据库中分别进行GO 分子功能（GO MF）、GO生物过程（GO BP）、GO细胞组分（GO CC）以及KEGG 通路富集分析。通过微生信进行富集分析得到图3。

图3 GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

2.4 KEGG通路富集分析

KEGG 通路富集分析共收集152 条通路，筛选出10 条关键通路。分别是AMPK 通路、NF-kappa B 通路、PI3K-Akt 通路、JAK-STAT 通路、mTOR 通路、Th17 细胞分化、MAPK 通路、TGF-β 通路、PD-L1/PD-1通路、COVID-19通路。如图4、图5所示。

<1)，且各件产品是否为不合格品相互独立．

图4 KEGG通路-靶点图Fig.4 KEGG pathway-target map

图5 KEGG通路富集分析气泡图Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 药物-活性成分-靶点-关键通路

基于以上结果，获得药物的活性成分、重要靶点和关键通路，导入Cytoscape 3.7.1 软件，构建“药物-活性成分-靶点-关键通路”网络模型，进行Network Ananlyze分析。见图6。

图6 药物-有效成分-靶点-关键通路图Fig.6 Drug-active ingredient-target-key pathway diagram

2.6 分子对接

从PDB 数据库中下载核心蛋白肿瘤因子（TNF）和白介素-6（IL-6）的3D信息结构，输出pdb格式，并利用Autodock 1.5.7 软件输出pdbqt 格式。将网络中度值最大的活性成分槲皮素（Quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）分别与PPI网络中确定的关键靶蛋白TNF 和IL6 进行分子对接分析，这些小分子化合物通过氢键结合到目标蛋白上，这是一种静电相互作用。在分子对接评分中，对接分数越低、构象越稳定，则结合活性越好，分子对接结合能均小于-5 kcal/mol。结果见图7和表3。

表3 苓桂术甘汤核心蛋白与核心有效成分结合能对接表Tab.3 Connection table of binding energy between core protein and core active ingredients of Linggui Zhugan decoction

图7 槲皮素、山奈酚、β-甾醇与关键靶蛋白TNF、IL6相互作用示意图Fig.7 Quercetin，kaempferol β-Schematic diagram of interaction between sterols and key target proteins TNF and IL6

苓桂术甘汤由四种不同的草药制成，即茯苓的干菌核、桂枝（肉桂的干枝）、白术（白术的干根茎）和甘草（甘草的干根和根茎）。此方以茯苓为君药，茯苓性甘淡，祛邪又扶正，实为利水之要药；
桂枝甘温，温脾以助水，温肾又祛邪；
白术为补气健脾之要药，性苦温燥湿，甘温补脾，祛邪兼扶正；
甘草性甘补脾；
茯苓、桂枝相配利水以平冲，白术伍甘草健脾以降逆，桂枝、甘草相配加强通阳之效[11]。苓桂术甘汤具有治疗多种疾病的作用，如非酒精性肝炎、心力衰竭、心梗后心室重构、糖尿病、阿尔兹海默症[12-13]等。

为了进一步研究与探讨苓桂术甘汤治疗新冠合并支气管哮喘的药效基础和潜在的生物学机制，本研究利用网络药理学技术筛选出有效成分及药效靶点与疾病靶点，构建PPI 网络，运用基因靶点富集分析及通路预测等手段，得到槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等核心活性成分。苓桂术甘汤治疗新冠肺炎合并支气管哮喘的靶基因作用网络以TNF 与IL6为核心，TNF 与IL6 作为炎症因子对气道损伤危害较大，持续性刺激呼吸道黏膜呈现高敏反应，使患者出现呼吸困难。槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇具有抗炎、提高免疫力、抗肿瘤的作用。槲皮素通过下调IL-4、IL-5、miR-155 的水平来改善卵清蛋白致使小鼠哮喘模型，对气道炎症水平有抑制作用，促使气道重塑[14]。槲皮素与山奈酚具有抗氧化、细胞保护、抗炎等作用，山奈酚在一定条件下抗氧化能力是槲皮素的100倍，抗炎特性明显增强[18]。在COVID-19 期间，SARS-CoV-2 感染可刺激PI3K-Akt 通路、JAK-STAT通路、mTOR 通路、MAPK 通路等多条信号通路，山奈酚被作为植物中提取的植物化学物质可能是对抗新冠肺炎的潜在候选药物[15]。在KEGG 富集分析中存在PI3K-Akt 通路、JAK-STAT 通路、mTOR 通路、MAPK 通路以及COVID-19 通路，因此苓桂术甘汤可为改善新冠肺炎合并支气管哮喘的潜在中药复方。

分子对接通过小分子配体和大分子受体，通过一系列对接选择合适的药物对接位点，并预测其亲和力，寻找受体小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象。在本文的所有配体化合物中，与TNF 和IL6 受体蛋白结合最稳定的为槲皮素，结合能为-7 kcal/mol。文献报道其IL6 可通过一定的信号通路对CVA大鼠具有较好的抗炎作用[16]。

综上所述，本研究运用网络药理学结合分子对接技术对苓桂术甘汤治疗新冠肺炎合并支气管哮喘的潜在药效成分、关键靶点及作用机制进行了初步预测，发现苓桂术甘汤治疗支气管哮喘具有调节多条信号通路的协同效应。所以，苓桂术甘汤可能通过影响机体细胞增殖分化、肿瘤因子及炎症、癌症的产生等多维度协同发挥平喘作用，为进一步实验验证苓桂术甘汤改善支气管哮喘的作用机制提供理论依据。

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