益肾结透合剂质量标准研究

任龙艳，杨 亮，梁 会，曾 真，蒋 玲，王 霞

（1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；
2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550000）

慢性肾功能衰竭即各种慢性肾脏疾病终末期综合征，病情恶化后导致残余肾功能难以将机体代谢废物排出或对内环境的稳定性予以维持，引起机体毒物或代谢废物潴留、酸碱或水电解质平衡失调等内环境紊乱或泌尿功能障碍［1-3］。益肾结透合剂是贵州中医药大学第二附属医院临床治疗慢性肾功能衰竭的协定处方，由白茅根、荷叶、生大黄、生龙骨、生牡蛎、丹参、当归、甘草8味中药组成，具有降逆泄浊、益气活血的功效。本研究采用薄层色谱法（TLC）对合剂中的白茅根、荷叶、生大黄进行鉴别，并建立高效液相色谱法（HPLC）测定白茅根中绿原酸含量的方法，为益肾结透合剂的质量控制提供科学依据。

1.1 仪器 FA2204N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）；
LC-2040C 3D 型高效液相色谱仪（PDA 检测器，日本岛津仪器有限公司）；
UV-5900 型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；
SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；
HH-2型数显恒温水浴锅（常州市华普达教学仪器有限公司）；
OSB-2100 型Eyela 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；
低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试药 益肾结透合剂（批号分别为20181111、20181112、20181113）由贵州中医药大学第二附属医院制剂室提供；
绿原酸对照品（批号110715-201318，含量为93.3%）由中国食品药品检定研究院提供；
白茅根、荷叶、生大黄对照药材（批号分别为20181001、20180101、20180201）均购于贵阳济仁堂中药饮片厂；
缺白茅根、荷叶、生大黄的阴性样品制剂均由贵州中医药大学第二附属医院制剂室提供；
乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2.1 TLC鉴别

2.1.1 白茅根 取50 ml 益肾结透合剂溶液蒸干，残渣置于50 ml 具塞平底烧瓶中，加入20 ml 乙醚溶液，通过超声波清洗机超声提取10 min 后过滤，蒸干，并加入1 ml 乙醚溶液溶解制备得供试品溶液。精密称取白茅根对照药材1 g，同法制备白茅根对照药材溶液。取50 ml 缺白茅根的益肾结透合剂阴性样品，同法制备缺白茅根的阴性对照溶液。按2020年版《中华人民共和国药典》四部中薄层色谱法（通则0502）试验［4］，分别吸取供试品溶液、白茅根对照药材溶液和缺白茅根的阴性溶液各4µl，在同一硅胶G 薄层板上点样，以三氯甲烷为展开剂进行展开，取出，晾干，然后在紫外光灯下365 nm 处检视［5］。结果显示，供试品溶液在与白茅根对照药材色谱相应位置上呈现相同颜色的斑点，且阴性对照溶液与供试品溶液之间相互无干扰（图1A）。

图1 薄层色谱图

2.1.2 荷叶 取50 ml 益肾结透合剂溶液蒸干，残渣置于10 ml容量瓶中，并用甲醇溶液定容至刻度，超声提取30 min后过滤，蒸干，再加入0.5 ml甲醇溶液溶解制得供试品溶液。精密称取荷叶对照药材1 g，同法制备荷叶对照药材溶液。取50 ml 缺荷叶的益肾结透合剂阴性样品，同法制备缺荷叶的阴性对照溶液。根据2020 年版《中华人民共和国药典》四部中薄层色谱法（通则0502）试验［4］，分别吸取供试品溶液、荷叶对照药材溶液和缺荷叶的阴性溶液各4µl，于同一硅胶G 薄层板上点样，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶4∶2∶1）下层液为展开剂进行展开［6］，取出，晾干，再喷以稀碘化铋钾试液显色，在紫外光灯下365 nm 处检视。结果显示，供试品溶液在与荷叶对照药材色谱相应位置上呈现相同颜色的斑点，且阴性对照溶液与供试品溶液之间相互无干扰（图1B）。

2.1.3 生大黄 取100 ml 益肾结透合剂溶液蒸干，残渣置于50 ml 具塞平底烧瓶中，精密量取甲醇溶液20 ml 浸泡1 h 后过滤，取5 ml 续滤液蒸干，残渣置于10 ml 容量瓶中，用纯净水定容至刻度，再加入1 ml 盐酸溶液，加热回流30 min 后，立即冷却，采用乙醚振摇提取，共提取2次，每次乙醚用量为20 ml，合并滤液后蒸干，加入1 ml 三氯甲烷溶液稀释制得供试品溶液。精密称取生大黄对照药材0.1 g，同法制备生大黄对照药材溶液。取100 ml 缺生大黄的益肾结透合剂阴性样品，同法制备缺生大黄的阴性对照溶液。根据2020年版《中华人民共和国药典》四部中薄层色谱法（通则0502）试验［4］，分别精密吸取供试品溶液、生大黄对照药材溶液和缺生大黄的阴性溶液各4 µl，于同一硅胶G 薄层板上点样，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（7∶3∶1）的上层溶液为展开剂进行展开［7］，取出，晾干，在紫外光灯下365 nm 处进行检视。结果显示，供试品溶液在与生大黄对照药材色谱相应位置上呈现相同颜色的斑点，且阴性对照溶液与供试品溶液之间相互无干扰（图1C）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Welch Ultimate PolarRP C18柱（4.6 mm×250 mm，5µm）；
检测波长为326 nm；
流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液（95∶5）；
柱温为30 ℃；
流速为0.8 ml/min；
进样量为10µl。其理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于4 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品在减压干燥箱内60 ℃下干燥4 h，精密称取0.001 g，置于10 ml 容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取益肾结透合剂150 ml，蒸干，残渣加入70%乙醇溶液100 ml，加热回流30 min后过滤，蒸干，残渣置于50 ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀；
精密量取1 ml贮备液置于10 ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阴性溶液的制备 取缺白茅根的益肾结透合剂阴性样品适量，按“2.2.3”项下方法制备得阴性溶液。

2.2.5 系统适应性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10µl，按照“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果显示，对照品溶液与供试品溶液在相同保留时间处有对应的色谱峰，与相邻峰基线分离良好，且与阴性溶液相互无干扰，表明该方法专属性良好，见图2。

图2 HPLC色谱图

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液3µl、4 µl、9 µl、12 µl、15 µl、17 µl、20 µl 注入色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以绿原酸进样量（µg）的常用对数（X）为横坐标，峰面积（A）的常用对数（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=65 304X+62 016（r=0.999 8）。结果显示，绿原酸进样量在0.3～2.0 µg 之间与峰面积呈现出良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 分别精密吸取对照品溶液10µl，按照“2.2.1”项下色谱条件重复进样测定6 次，结果绿原酸峰面积的相对标准偏差（RSD）值为1.69%（n=6），表明该仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取同一批号（20181111）样品，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6 份，再按照“2.2.1”项下色谱条件进行检测，记录其峰面积并计算绿原酸含量，结果绿原酸的平均含量为4.007 mg/ml，RSD值为2.11%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别放置0 h、3 h、6 h、9 h、12 h 后进样检测，记录其峰面积。结果绿原酸峰面积RSD 值为2.08%（n=5），表明供试品溶液在室温条件下12 h内稳定。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的绿原酸对照品13.96 mg，置于10 ml 容量瓶中，加70%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备液；
分别精密量取6 份已知含量（绿原酸含量为4.24 mg/ml）的样品（批号：20181111）各0.8 ml，置于50 ml锥形瓶中，再分别精密吸取对照品贮备液（浓度为1.95 mg/ml）各2 ml；
按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进行检测，并记录峰面积，计算加样回收率。结果显示，平均回收率为100.73%，RSD值为1.75%（n=6），见表3。

表3 加样回收率试验结果

2.2.11 样品含量测定 取益肾结透合剂3 批（批号：20181111、20181112、20181113），按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，每批平行测定2次，计算各样品中绿原酸的含量，结果见表4。

表4 3批样品含量测定结果（mg/ml）

通过对3 批益肾结透合剂样品进行测定，结果绿原酸平均含量为3.86 mg/ml。从大批量生产规模角度考虑，制备工艺设定每瓶为150 ml，根据80%含量限度计，故本品每瓶含绿原酸（C21H18O11）应不得少于463 mg。

在前期预试验中，课题组采用薄层色谱法对各味中药材的成分进行了鉴别试验研究。薄层色谱图中，荷叶、生大黄、白茅根在与对照药材色谱相应的位置上呈现出同一颜色的斑点，阴性溶液与供试品溶液之间不存在相互干扰的情况，故将其纳入鉴别质量标准。而生龙骨、生牡蛎、甘草及当归虽与其对照品药材色谱在相应位置上呈现出同一颜色斑点，但阴性溶液与供试品溶液之间存在相互干扰；
丹参与其对照药材Rf值未在规定范围内。因此，此五味中药材的定性鉴别均未列入质量标准草案。

绿原酸在医药保健、日用化工及食品等行业应用广泛［8-9］，具有抑菌、消炎、抗癌、抗病毒、增强免疫调节、降糖及降血脂等多种药理作用［10-11］。课题组通过对益肾结透合剂处方配伍关系的分析，并查阅相关文献，确定以绿原酸为益肾结透合剂的含量测定指标。在色谱条件的选择上，曾考察不同比例的流动相对供试品溶液的影响。结果表明，在流动相进行细微的调整时，绿原酸色谱峰分离度差异性不大，且绿原酸含量差异不显著。考虑到含量最大化、所用时间少等因素，故选用乙腈-0.05%磷酸水溶液（95∶5）为流动相，分离度及峰形均良好，基线较平稳，组分间互不干扰。

实验结果证明，本研究中建立的方法简便易行，灵敏度较高，专属性较强，结果稳定可靠，能较好地控制益肾结透合剂的质量。

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