蛋白质二硫键异构酶结构与相关疾病研究进展

葛璟燕,檀 维,洪大伟,张 蓓

(浙江工业大学 生物工程学院,浙江 杭州 310014)

蛋白质是生命活动的物质基础,其合成过程须经过多肽链的正确折叠,形成三维构象,从而具备生理活性。蛋白质的正确折叠对其在生物体内发挥作用至关重要[1]。其中,蛋白质在内质网折叠过程中,两个半胱氨酸残基间形成的二硫键是获得蛋白质正确构象的重要步骤之一。在真核细胞中,近三分之一蛋白的结构中,至少含有一个二硫键[2]。在这个过程中,蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase,PDI)发挥了不可忽视的作用。PDI作为一种氧化还原酶,负责蛋白折叠过程中二硫键的裂解、形成和重排[3-4]。此外,PDI也通过催化天然蛋白二硫键的异构化,调节相应的蛋白质折叠,发挥蛋白伴侣的功能并维持细胞稳态[5]。研究表明在多种疾病中PDI表现出过表达或失活状态。笔者将从PDI家族的结构、种类、活性检测方法和相关疾病等方面进行综述,以期为PDI及其病理研究提供新思路。

到目前为止,已发现了21个PDI家族成员,由于其他PDI家族成员的结构和机制特征与典型的PDI(PH4B,PDIA1)类似,故以PDI为例简单阐述其家族的结构[6-8]。PDI结构域如图1所示,其含有4个Trx结构域(a,b,b′,a′)、一个链接子X和C末端延伸区,其中C末端包含内质网驻留信号肽序列KDEL。这4个域使得PDI呈现U型结构,U型转折裂缝含有疏水表面,使酶能够特异性地结合展开的底物,识别结合折叠的蛋白[9-10]。a和a′结构域均含一个由CXXC序列(X是任意一天然氨基酸)组成的活性催化位点,独特的4个半胱氨酸侧链巯基参与底物二硫键的交换反应。a结构域起催化作用,a′结构域起非催化作用,影响着PDI催化的活性[9]。CXXC序列中的两个半胱氨酸残基的侧链既可以是自由巯基,也可以形成一对二硫键,与新合成的蛋白质的巯基发生反应,并且氧化还原能力受中间两个氨基酸的影响。任意一个半胱氨酸活性位点的缺失可导致酶催化能力减弱一半[11],两个位点同时受到抑制则会导致酶催化功能的丧失[12]。

在内质网中,约50% PDI的a和a′结构域活性中心处于还原状态,另外15% PDI的a′结构活性中心处于氧化态[13]。N末端的活性半胱氨酸一般裸露在蛋白质表面,pKa值为4.5～5.6;而C末端的半胱氨酸在内部疏水区,pKa值为12.8[14-15],因此PDI蛋白的活性呈现pH依赖性。PDI活性中心的氧化-还原状态与其发挥的功能息息相关。当PDI的活性中心处于氧化态时,底物的二硫键得以形成,PDI则形成还原状态;相反,当PDI的活性中心处于还原态时,底物会被氧化或异构化。当PDI活性中心氧化还原状态发生紊乱时,未折叠或错误折叠蛋白开始积累,引起内质网应激(ER stress),细胞会通过未折叠蛋白反应UPR(Unfolded protein response)来维持内质网稳态。如果内质网应激过强或持续时间过长,则会导致细胞启动凋亡程序[16-17]。消除紊乱的蛋白则需要建立一个平衡机制来应对UPR,以防止因病理蛋白导致的疾病的发生。

b和b′结构域主要负责参与底物的识别结合,序列相似度(16.5%)比a和a′结构域(33.6%)小,bb′非催化结构域与aa′催化域相比表现出更多的结构多样性,且不含CGHC序列,因此没有氧化还原活性[6]。

Denisov等[18]利用核磁共振滴定实验发现未折叠核糖核酸酶、胡蜂蜂毒肽及生长抑素与b′结构域的疏水表面结合。相较于b和其他结构域,b′结构域展现出更大的序列多样性,其主导底物结合的特异性。另外,X链接子也起到一定的调节作用。X链接子大约由20个氨基酸组成,位于a′与b′结构域之间。通过b′X晶体结构的测定及模拟,发现X链接子可稳定底物与b′结构域的N端部分(7个氨基酸)垂直进入b′结合域β5折叠股,而C端部分折回并靠近b′结合域α1和α2螺旋疏水表面。当去除X链接子时,b′结合域的稳定性下降[19]。X链接子仿佛起到桥梁的作用,使各部分紧密相连,更好地发挥彼此的功能。

PDI家族成员有21个,具体如表1所示。PDI家族成员的共性很多,其主要功能是催化新生肽链的氧化折叠,发挥蛋白氧化还原、异构和分子伴侣等的作用,然而PDI家族成员的生物功能不尽相同,尤其酶活性、催化底物都有很大的差别。目前针对PDI家族的体外研究较多,由于体内环境复杂,参与的底物丰富,并且与底物形成的复合物寿命较短,使得针对PDI家族的体内研究较少,其功能仍有待开发。PDI家族成员之间的功能有一定重叠,当缺少某一种时,其他的成员相应回补挽救,因此对单一成员的研究有一定难度。下面将简单介绍以下3种了解较透彻的PDI成员。

表1 人类PDI家族蛋白概览

2.1 PDI(PDIA1,PH4B)

PDI在内质网腔中的含量最高,含有KDEL序列,主要在内质网中驻留,可达到毫摩尔每升的水平,其通过催化蛋白底物的氧化折叠改变底物状态而发挥不同生理作用[10]。研究发现:当PDI活性位点被抑制,细胞PDI基因被敲除后,会影响细胞的生长和分化[20],而非活性位点的突变也会影响其活性[21]。同时PDI家族的其他成员不能完全代替并挽救PDI的生物功能。PDI的底物具有多样性:CHO细胞被病毒感染,两种病毒膜糖蛋白可与PDI形成瞬时的合二硫代物[22];在成纤维细胞中,PDI与其底物前胶原I和前胶原Ⅲ之间存在密切联系[23];在分泌二聚体蛋白甲状腺球蛋白的甲状腺细胞中,甲状腺球蛋白的瞬时折叠中间体可与PDI形成二硫键[24]。PDI催化蛋白折叠过程中二硫键的氧化还原,其构象处于一个动态的过程,从而维护内质网稳态[25]。

2.2 ERp57(PDIA3)

ERp57是PDI家族中功能被研究得比较透彻的一个氧化还原性质的分子伴侣。ERp57可以清除错误折叠的蛋白质,抵抗内质网胁迫诱导的细胞凋亡[26]。ERp57底物结合的特异性与PDI相似。ERp57可以与凝集素伴侣分子钙联蛋白CNX和钙网蛋白CRT结合。用药物干扰CNX和CRT的结合位点可有效阻止ERp57和糖蛋白的相互作用[27-28],因此糖蛋白二硫键的形成可能与ERp57催化功能相关。细胞表面CNX-ERp57复合物还原胞外二硫键是细胞外基质降解的必要条件[29]。ERp57也可作为补体来调控凝集素途径[30]。

Blees等[31]通过低温电子显微镜发现ERp57是主要组织相容性类MHC-1肽组装复合体的一部分,通过a和a′区域的U型结构与伴侣分子Tapasin结合形成二硫键,参与对肿瘤和病毒的免疫反应。MHC-I通路中两个重要因子ERp57和Tapasin的相互作用对抗原提呈肿瘤细胞产生显著影响[32]。血凝素作为一种表面免疫原蛋白,是流感病毒的重要组成部分。ERp57可以还原血凝素,降低二硫键绑定的血凝素三聚体的百分比,从而提高H3N2流感病毒血凝素的稳定性和免疫原性[33]。对ERp57的研究有助于开发预防流感大流行的疫苗。

2.3 ERp44(PDIA10)

ERp44由a-b-b′ 3个域构成V型结构,N端含有CRFS序列,然而缺乏C端的活性区域[34]。ERp44主要定位于内质网-高尔基体中间室和顺式高尔基体区域,其C末端会因亚细胞pH的差异导致ERp44结构的改变,从而影响ERp44与底物的结合[35-37]。ERp44的底物较广泛,包括内质网氧化还原酶Ero1α和Ero1β(高度保守的黄素酶,与FAD一起产生二硫键并优先将其转移到蛋白质二硫键异构酶上)、Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受体ITPR1等。ERp44在内质网应激中被诱导,通过C29位点特异性与内质网氧化还原酶Erolα结合,并形成二硫键交联中间体,通过该介导作用,使得Ero1α活性降低且滞留在内质网中[38]。ERp44与三磷酸肌醇受体间的相互作用对细胞内钙稳态调节起到重要作用[39]。

ERp44也参与病理的发生和发展,可作为结直肠癌患者复发情况的指示蛋白[40]。敲低ERp44的表达水平,细胞凋亡相关蛋白如caspase-3,GRP78水平升高,caspase-12被激活,表明内质网应激诱导细胞凋亡,进一步表明ERp44沉默通过激活内质网应激导致细胞凋亡[41]。

PDI是一种氧化酶、还原酶及异构酶,在过去的几十年里,测定PDI酶活性以及筛选抑制剂的方法相对成熟。下面将简单讨论PDI酶的3种活性测定方法,以便用于高通量筛选PDI抑制剂,同时也将简单阐述这些方法的优缺点。

3.1 还原活性测定

3.1.1 胰岛素浊度测定方法

胰岛素由A,B两条肽链通过二硫键交联组成[42]。PDI作为一种还原酶可以破坏A,B链之间的两个二硫键,致使B链聚集,而A链仍可溶。因此一般在供体谷胱甘肽或二硫苏糖醇存在下,最终以过氧化氢淬灭反应,通过OD650可检测B链的浊度,从而间接得知PDI还原酶的活性[43]。该检测方法虽然简单、经济且高效,可以用于高通量抑制剂筛选,但浊度的灵敏度较低,谷胱甘肽和二硫苏糖醇也存在一定的还原能力,检测过程中容易出现假阴性的情况。

3.1.2 荧光检测方法

荧光检测方法利用两个相同发色基团(氨基苯、伊红)连接在氧化型谷胱甘肽的两边,PDI的加入使得中间二硫键断开,荧光基团的淬灭效应降低,荧光增强[44]。根据荧光的强度计算PDI的活性。该方法简单且灵敏度比胰岛素浊度法高,适用于血小板等复杂样本中PDI活性的测定。

3.2 氧化活性测定

PDI最初是因其具有催化还原RNase复性的能力而被分离出来的。RNase通过催化磷酸二酯键的水解来消化RNA,不活跃的还原性RNase被PDI氧化而复性。具有活性的RNase随后催化循环单磷酸胞苷(cCMP)水解生成CMP,导致296 nm处的吸光度增加。因此cCMP的水解速率间接反映了PDI的氧化酶活性。然而该方法的影响因素较多,如反应的pH、盐浓度、cCMP和复性的程度等。同时,很多抑制剂也会在测量波长下有吸收,导致该方法的局限性较大[45]。

3.3 异构酶活性测定

PDI可以催化被完全氧化并形成杂乱的二硫键失活状态的RNase中分子间和分子内二硫键的交换异构,从而导致新的二硫键的形成,使RNase酶活性恢复。利用RNA作为底物,RNase活性的测定间接反映了PDI的异构酶活性。然而该方法依赖含无序二硫键的RNase的制备,批次之间的重复率不高[46]。

目前针对PDI及其家族的研究虽然越来越多,了解得也越来越透彻,但其低表达或过表达都可能会导致疾病的发生,下面重点简述与PDI相关的几种疾病。

4.1 PDI与癌症

近期,通过芯片技术和蛋白质组学发现在脑癌[47]、淋巴癌[48]、肺癌[49]和卵巢癌[50]等不同的癌症组织中PDI至少上调两倍。PDI也在乳腺癌的细胞间隙液中高表达,可作为乳腺癌前期检测的生物标志物。高表达的PDI也与癌症的转移和侵袭相关,针对ER折叠因子,特别是PDI家族成员,可能改善转移性乳腺癌的治疗效果[51]。目前,针对PDI抑制剂的开发也逐渐增多。比如Neamati课题组通过将PACMA31与荧光物质BODIPY结合,发现PACMA31是PDI的共价结合抑制剂,抑制PDI的Cys397或Cys400活性位点,同时在不同的卵巢癌细胞系中表现出较好的抑制效果[50]。

4.2 PDI与神经退行性疾病

神经退行性疾病,比如阿尔茨海默病、帕金森、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症等,表现为认识和记忆力下降,主要因蛋白质的错误折叠引起[52]。而PDI家族的主要功能就是辅助蛋白质折叠,因此也受到了关注。阿尔茨海默病(AD)的特点之一是产生过多的一氧化氮,使得PDI的活性半胱氨酸S-亚硝基化(SNO-PDI),从而抑制其活性,导致多聚泛素的堆积,并激活未折叠蛋白应答[53-55]。最近研究表明:SNO-PDI不仅丧失了识别靶蛋白的能力,而且也丧失了抑制AD患者脑内异常沉积的Tau蛋白相分离(相分离描述的是一种细胞内不同组分相互碰撞形成液滴的现象)的能力。无论是野生型PDI还是活性位点中半胱氨酸突变后的PDI均能显著抑制细胞中Tau蛋白的病理磷酸化和异常聚集,降低Tau蛋白导致的毒性,这对SNO-PDI和Tau蛋白在神经疾病中的作用机制有了更进一步的阐释,并为治疗疾病提供了思路[5]。

Stockwell课题组在68 000多个小分子库中发现该16F16小分子可特异性抑制PDI和ERp57的活性,从而减弱其调控的聚谷酰胺诱导亨廷顿病细胞模型凋亡的作用[56]。后来又筛选出了具有神经保护作用的一叶秋碱Securinine生物碱,确定了其在亨廷顿病细胞模型中具有保护作用[57]。该研究为寻找新的PDI抑制剂提供了方法和思路。

4.3 PDI与艾滋病

PDI不仅在内质网中起作用,也在细胞表面催化二硫键的形成。该功能有助于一些病毒和细菌的侵入,比如HIV病毒[58]、新城疫病毒[59]等。PDI通过催化糖蛋白gp120中二硫键的还原切割实现HIV-1与细胞的融合[60-61]。在HIV-1主要受体CD4附近有10～14个PDI簇,它们与PDI和HIV-1包膜糖蛋白gp120有单独的结合位点。HIV-1的gp120与CD4结合,随后PDI催化还原gp120中的二硫键,导致gp120的主要构象发生变化,增强gp120与共同受体CCR5和CXCR4的作用。随后,一种非共价结合gp120的病毒糖蛋白gp41重新排列并与细胞膜作用,导致病毒包膜与细胞膜融合,使得病毒侵入细胞[62]。因此,PDI也被认为是一种治疗HIV的潜在药物靶点。

Osada课题组利用高通量的胰岛素聚集浊度分析方法,从10 000种天然产物中筛选到可抑制PDI催化gp120还原的juniferdin先导化合物,从而阻止病毒粒子的进入[58]。据报道,有一种宿主细胞蛋白SERINC5可通过改变病毒粒子上的gp120构象或物理掩蔽特定的HIV-1病毒粒子表位来抑制HIV-1的感染性[63]。SERINC5抑制HIV-1感染的确切机制虽然尚不清楚,但可针对病毒粒子设计新的抗病毒策略。

4.4 PDI与血栓

血栓形成过程中PDI扮演着重要的角色[64]。自20世纪90年代发现PDI在血小板功能中起作用以来,科学家致力于探究血小板PDI参与动脉血栓形成的分子机制[65]。抑制细胞外PDI活性可以减少激光引起的血栓形成过程中血小板的聚集和纤维蛋白的沉积[66]。胞外PDI可能是预防和治疗血管疾病的一个新的治疗靶点。单宁酸作为一种PDI结合植物多酚能够在体外抑制PDI还原酶活性,减少血小板表面硫醇的生成,抑制PDI活性、血小板活化和血栓形成[67]。通过下腔静脉部分狭窄小鼠模型可知,PDI抑制剂PACMA31可抑制血小板沉积和纤维蛋白形成,并且抑制方式取决于骨髓细胞的组织因子。不过最近证明PDI家族的跨膜成员TMX1可以抑制血小板功能和血栓形成,这表明PDI在血栓形成中也可能具有相反的功能[68]。

综上所述,PDI的结构功能与疾病之间存在着密切的关系。目前,PDI抑制剂的开发虽然取得了一定的进展,但抑制剂只能抑制PDI的单个活性位点,且PDI在不同亚细胞器中还有一些未知的功能,其在疾病发生和发展中的作用机制也尚未明确。未来本课题组将通过PROTAC技术来实现PDI的完全降解,并尝试对其致病下游蛋白的表达情况进行阐述。相信随着研究技术的不断创新,PDI在疾病过程中的作用机制将被逐一解释,相关疾病的预防和治疗也将成为可能。

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