褪黑素调控自噬及铁死亡增强胰腺癌细胞PANC-1对吉西他滨的化疗敏感性*

曹健,董钦鹏,曾炼,李恒平,刘君瑞,孙晓东,王青松,胡鹏超

(1.锦州医科大学湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院研究生联合培养基地,襄阳 441000;2.华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科,武汉 430030;3.湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院普通外科,襄阳 441000;4.湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院转化医学中心,襄阳 441000)

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,5年生存率约为10%。胰腺导管腺癌是胰腺癌中最常见和最具侵袭性的亚型,约占胰腺癌总数的90%,其预后不良可能与早期转移和高侵袭性有关[1-3]。临床上,以化学治疗(化疗)为主的综合治疗是治疗胰腺导管腺癌的主要方法。吉西他滨是一种胞嘧啶核苷衍生物,是治疗胰腺导管腺癌的一线化疗药物,可作为竞争性底物掺入DNA链并终止其复制,最终导致细胞死亡,但很多患者在治疗过程中出现化疗敏感性下降,需提高其药物浓度才能产生效应,导致临床应用受限[4-6]。因此,迫切需要发现一种更有效的化疗组合,为化疗增敏和改善胰腺导管腺癌总体预后提供新的策略。

褪黑素是一种吲哚类化合物,主要由松果体在夜间正常的明暗条件下合成和分泌。它是一种多效性分子,具有多种生理功能,包括抗氧化、免疫调节、抗衰老和抑制肿瘤等[7-9]。越来越多的证据表明褪黑素可以抑制多种癌症的进展并增强其化疗敏感性,也包括胰腺癌。JU等[10]的研究发现褪黑素可通过抑制NF-κB的激活增加胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性。除此,褪黑素也可通过调节细胞自噬进而抑制肿瘤的增殖及侵袭。GILLSON等[11]的研究发现胰腺癌的生长依赖于自噬,使用自噬抑制剂可逆转胰腺癌的进展以及增加其化疗敏感性。除自噬外,有研究发现靶向诱导肿瘤细胞铁死亡可逆转肿瘤对化疗药物的耐药性[12]。而目前尚不确定褪黑素增敏胰腺癌对化疗药物敏感性与细胞自噬和铁死亡的关系。因此,本研究旨在探讨褪黑素联合吉西他滨对胰腺癌细胞株PANC-1化疗敏感性的作用及其潜在的作用机制。

1.1实验材料

1.1.1药物与试剂 高糖细胞培养基H-DMEM(批号:11965092)、胰蛋白酶(批号:25200072)购自赛默飞世尔科技公司;褪黑素(批号:S1204)、吉西他滨(批号:S1714)购于Sellecks生物科技有限公司;细胞活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8,批号:BS350B)购自白鲨生物科技有限公司;活性氧检测荧光探针-DHE分析试剂盒(批号:KGAF019)和JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(批号:KGA603)购自江苏凯基生物技术股份有限公司;细胞亚铁离子检测荧光探针(批号:F374)购自东仁化学科技有限公司(Dojindo);凝胶快速制备试剂盒(批号:WLA013)购自沈阳万类生物科技有限公司;抗GPX4(批号:67763-1-Ig)、抗SLC7A11(批号:26864-1-AP)、抗P62(批号:18420-1-AP)、抗LC3(批号:14600-1-AP)抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司;DyLight 488绿色荧光II抗(批号:ab96899)购自艾博抗生物科技有限公司;蛋白浓度测定试剂盒(批号:P0012)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(批号:A0208)和山羊抗鼠 IgG(批号:A0216)、细胞核染料 Hoechst 33258 (批号:C1011)及线粒体红色荧光探针 Mito-Tracker Red CMXRos(批号:C1035)购自杭州碧云天生物技术有限公司。

1.1.2设备与仪器 蛋白质电泳及转膜设备购自伯乐生命医学产品有限公司;SpectraMax i3x酶标仪购自美谷分子仪器有限公司;IX70倒置荧光显微镜购自奥林巴斯工业有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人胰腺癌细胞株PANC-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司(批号:CL-0184),后由实验室保存。人胰腺癌细胞株PANC-1培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中,置于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒温培养箱中培养,待细胞增殖达60%～80%进行细胞传代,取处于对数增长期的细胞进行接种。

1.2.2CCK-8法检测细胞活力 将处于对数生长期的胰腺癌细胞株PANC-1细胞接种于96孔细胞培养板中,每孔细胞约5×103个,设立空白对照组、吉西他滨组(1、2、4、8、16 μmol·L-1)及联合处理组(4 μmol·L-1吉西他滨+0.25、0.5、1、2 mmol·L-1褪黑素),培养48、72 h后,加入CCK-8溶液(每孔10 μL),37 ℃孵育箱培养1～4 h,荧光酶标仪(激发光波450 nm)测定每孔吸光度,每组设3个复孔,以空白孔调零,计算细胞相对活力。

1.2.3克隆形成实验 将PANC-1细胞以每孔1×103个细胞的密度接种到6孔板中,待细胞贴壁后加药,分别设立空白对照组、褪黑素(1 mmol·L-1)组、吉西他滨(4 μmol·L-1)组以及联合处理组,放入细胞培养箱中培养48 h后更换培养基,再继续培养2周,直到通过肉眼能清晰可见的细胞克隆,弃培养基,PBS洗涤,用4%多聚甲醛固定15 min,0.1%结晶紫染色20 min。晾干后观察细胞集落并摄像。

1.2.4划痕实验 将PANC-1细胞在6孔板中培养,在细胞密度为90%的情况下,使用200 μL塑料枪头沿直线在孔底划线,PBS洗涤2次,培养于含有2% FBS的DMEM中,设立分组同“1.2.3节”,在0和48 h摄像,计算划痕闭合率。

1.2.5细胞迁移实验 加药处理过的细胞经胰酶消化(设立分组同“1.2.3节”),用无血清培养基配成细胞密度为5×104个·mL-1的细胞悬液,在transwell上室加入细胞悬液200 μL,下室加入含有10%FBS的DMEM 500 μL。培养箱内培育24 h后,PBS洗涤2次,4%多聚甲醛固定15 min,0.1%结晶紫染色,洗涤。用棉签轻轻擦去上室的贴壁细胞,在倒置显微镜下观察3个视野(×100),用ImageJ计算迁移细胞的数量,通过每组transwell的迁移细胞数比较细胞的迁移能力。

1.2.6细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测 将PANC-1细胞以每孔1×104个细胞的密度接种至24孔板,随机分组,取对数生长期的细胞进行实验,各组处理如上述,培养48 h后,使用ROS红色荧光探针二氢乙啶(DHE)标记细胞中的ROS 20 min,然后用PBS洗涤2次,置于荧光显微镜下观察并摄像,并用 Image J 软件分析荧光强度。

1.2.7线粒体膜电位JC-1检测 将PANC-1细胞以每孔1×104个细胞的密度接种至24孔板,随机分组,取对数生长期的细胞进行实验,各组处理如上述,培养48 h后,弃掉孔中培养基,用PBS洗涤2次,加入线粒体膜电位检测试剂盒中的JC-1工作液覆盖细胞,置于培养箱孵育15 min后,用1×缓冲液洗涤2次后,加入4%多聚甲醛室温固定30 min,用PBS洗涤2次,加入Hoechst 33258标记细胞核,室温染色15 min,置于荧光显微镜下进行观察并摄像,并用 Image J 软件分析荧光强度。

1.2.8亚铁离子(Fe2+)检测 将PANC-1细胞以每孔1×104个细胞的密度接种至24孔板,随机分组,取对数生长期的细胞进行实验,各组处理如上述,培养48 h后,弃掉孔中培养基,用PBS洗涤2次,每孔加入终浓度为1 μmol·L-1的亚铁离子染色工作液200 μL,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养30 min,在荧光显微镜下观察细胞并摄像,用 Image J 软件分析荧光强度。

1.2.9蛋白印迹实验 按上述分组处理细胞48 h后,在低温环境下加入RIPA裂解蛋白15 min,超声破碎细胞,细胞悬液收集至3 mL离心管中,4 ℃,12 000 r·min-1(r=6 cm)离心10 min后弃上清液。使用BCA试剂盒检测蛋白浓度,每个样本取20 μL进行SDS-PAGE,半干转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,缓冲盐溶液洗膜后加入特异性I抗,I抗稀释比例为GPX4(1：1 000)、SLC7A11(1：1 000)、LC3(1：2 000)、P62(1：1 000)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(1：2 000),4 ℃孵育过夜,缓冲盐溶液洗膜5 min×3次,Ⅱ抗(1：2 000)室温孵育1.5 h,缓冲盐溶液洗膜3次后加入显影液进行显影,采用Bio-Rad凝胶成像系统对灰度值进行相对定量。

1.2.10免疫荧光染色 将PANC-1细胞以每孔1×104个细胞的密度接种至载玻片上,取对数生长期的细胞进行实验,各组处理如上述,48 h后弃去培养液,用预冷的PBS洗涤细胞2次,加入4%多聚甲醛室温固定细胞30 min,PBS洗涤后使用0.2% Triton X-100透膜10 min,加入含1%马血清的磷酸缓冲液溶液室温封闭2 h,使用抗LC3抗体(1：400)4 ℃孵育过夜,磷酸缓冲液洗涤3次,每次5 min,DyLight 488绿色荧光Ⅱ抗(1：1 000)避光室温孵育2 h,磷酸缓冲液洗涤后,用Hoechst 33258复染核,置于荧光显微镜下观察并摄像。

2.1褪黑素增强吉西他滨对PANC-1细胞增殖能力的抑制作用 与空白对照组比较,胰腺癌细胞株PANC-1细胞在高浓度的吉西他滨(>4 μmol·L-1)处理48、72 h后,细胞活力明显下降(图1A),呈时间剂量依赖性,低浓度吉西他滨处理48 h后细胞活力下降较少,其中4 μmol·L-1吉西他滨单独作用48 h细胞活力下降18.5%;而联合褪黑素处理后,随褪黑素浓度增加,细胞活力明显受限,其中4 μmol·L-1吉西他滨联合1 mmol·L-1褪黑素作用48 h后,细胞活力下降52.4%(图1B)。为进一步明确褪黑素联合吉西他滨对PANC-1细胞增殖的抑制效应,采用平板克隆实验,结果如图1C所示:与空白对照组比较,4 μmol·L-1吉西他滨处理后细胞克隆形成轻度受限,而联合褪黑素处理后,克隆形成明显减少。见图1。

A.吉西他滨处理PANC-1细胞48 h和72 h后的细胞活力;B.吉西他滨联合不同浓度褪黑素处理PANC-1细胞48 h后的细胞活力;C.克隆形成实验。①与空白对照组比较,t=3.29～54.2,P<0.05;②与吉巴他滨(4 μmol·L-1)组比较,t=6.74～17.9,P<0.05。

A.划痕实验;B.细胞迁移实验;C.PANC-1细胞的迁移率;D.PANC-1细胞迁移的数量。①与空白对照组比较,t=1.67～7.74,P<0.05;②与吉西他滨组比较,t=10.44～18.90,P<0.01。

A.检测不同处理过后细胞内ROS的水平;B.荧光强度的定量。①与空白对照组比较,t=-4.63,-5.61,P<0.01;②与吉西他滨组比较,t=-9.01,P<0.01。

A.标记细胞中的线粒体;B.细胞线粒体膜电位的检测;C.A图中荧光强度的定量;D.B图中红色荧光强度与绿色荧光强度的比值定量分析。①与空白对照组比较,t=3.97～6.32,P<0.01;②与吉西他滨组比较,t=7.90,16.97,P<0.01。

2.2褪黑素增强吉西他滨对PANC-1细胞迁移的抑制作用 空白对照组的PANC-1细胞迁移能力较强,划痕48 h后,细胞迁移率为73.4%,吉西他滨单独处理组细胞迁移率为57.3%,而吉西他滨联合褪黑素处理组细胞迁移明显受限,迁移率降低至18.6%;细胞Transwell结果再次证实褪黑素联合吉西他滨较吉西他滨单独处理明显抑制PANC-1细胞迁移,与空白对照组比较,吉西他滨组单独处理组细胞迁移数目减少不明显;而联合褪黑素处理后,迁移细胞数明显下降(P<0.01)。见图2。

2.3褪黑素联合吉西他滨诱导PANC-1细胞ROS的增加 与空白对照组比较,吉西他滨与褪黑素单独处理48 h后,代表ROS的红色荧光强度轻度增加;比较吉西他滨联合褪黑素与吉西他滨单独处理组ROS的合成,联合处理组中红色荧光强度显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

2.4褪黑素促进吉西他滨诱导PANC-1细胞线粒体功能障碍 与空白对照组比较,吉西他滨单独处理组Mito-tracker标记的线粒体(红色荧光)的平均吸光度轻度下降,而联合褪黑素处理后,红色荧光显著降低(P<0.01);JC-1线粒体膜点位检测证实褪黑素促进吉西他滨诱导PANC-1细胞线粒体膜点位的下降,结果如图4C所示:空白对照组细胞线粒体功能正常,呈现高红高绿的荧光信号,吉西他滨单独处理后,红色荧光强度轻度下降,而褪黑素联合吉西他滨处理组红色荧光明显下降,细胞呈现出高绿低红的荧光信号,代表细胞线粒体膜点位的降低,进一步比较红色荧光与绿色荧光的比值,与单独吉西他滨处理比较,联合处理组红绿荧光比值下降显著,差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

2.5褪黑素联合吉西他滨抑制PANC-1细胞自噬 免疫荧光结果如图5A,5C所示:空白对照组与吉西他滨单独处理组LC3(绿色)荧光强度类似,褪黑素组的荧光强度轻度下降,而吉西他滨联合褪黑素组荧光强度明显下降(P<0.01)。Western blotting结果见图5B、5D:与空白对照组比较,褪黑素组LC3B-II/LC3B-I比值降低,自噬底物p62表达增加,吉西他滨组LC3B-II/LC3B-I比值未见明显改变;而吉西他滨联合褪黑素组LC3B-II/LC3B-I比值明显降低,p62的表达显著增加,代表褪黑素联合吉西他滨抑制了PANC-1细胞自噬,差异有统计学意义(P<0.01)。

A.免疫荧光法检测LC3蛋白的表达水平;B.Western blotting法检测自噬相关蛋白LC3、P62的表达水平;C、D.B图中蛋白表达水平的定量分析。①与空白对照组比较,t=4.07,-4.22,-10.87,P<0.01;②与吉西他滨组比较,t=16.08,-6.13,P<0.01。

2.6褪黑素联合吉西他滨促进PANC-1细胞铁死亡 Fe2+检测结果见图6A、6B:空白对照组代表Fe2+的红色荧光强度较弱,单独使用吉西他滨和褪黑素组的红色荧光强度轻度增加;与吉西他滨单独处理组比较,吉西他滨联合褪黑素组的红色荧光强度显著增加(P<0.01)。Western blotting结果见图6C、6D、6E:与空白对照组比较,单用褪黑素和吉西他滨组的SLC7A11及GPX4的蛋白表达水平轻度降低;吉西他滨联合褪黑素组的SLC7A11及GPX4的蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

A.褪黑素和吉西他滨单独或联合处理PANC-1细胞后细胞内Fe2+水平;B.A图中荧光强度的定量分析;C.Western blotting法检测铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11的表达水平;D、E.图中蛋白表达水平的定量分析。①与空白对照组比较,t=-4.63,-10.43,9.16,11.52,9.08,8.69,P<0.01;②与吉西他滨组比较,t=-7.78,6.52,7.11,P<0.01。

胰腺癌是目前最致命的恶性肿瘤之一,且通常在晚期被发现,导致总体预后较差。吉西他滨作为胰腺癌化疗中的一线用药,其化疗敏感性的下降限制了其临床应用[13]。因此,提升胰腺癌的化疗敏感性一直都是临床研究的热点话题。褪黑素具有改善睡眠、调节免疫、抗肿瘤等多种生理功能,有研究发现其联合化疗药物使用可以明显增强化疗药物的敏感性。CHEN等[14]的研究显示,褪黑素对肝癌细胞具有抑制作用,并通过调控lncRNA RAD51-AS1增加肝癌细胞的化疗敏感性。本研究显示,低浓度的吉西他滨对胰腺癌细胞的增殖、迁移能力抑制作用较低,而联用褪黑素后明显抑制肿瘤细胞增殖,且褪黑素可通过增加ROS的合成、促进线粒体功能障碍、抑制细胞自噬以及促进肿瘤细胞铁死亡增强了胰腺癌细胞PANC-1对吉西他滨的化疗敏感性。

细胞自噬是细胞降解代谢废物的过程,包括细胞成分被降解和循环利用,这对维持细胞内环境稳态十分重要[15]。研究表明,与正常胰腺导管上皮细胞比较,胰腺癌细胞具有更高的自噬水平,是肿瘤细胞的生长和转移的关键因素[16]。这些肿瘤细胞通过促进自噬有效的清除代谢废物,维持较高的细胞活性,从而有助于抵抗化疗药物对其造成的损伤,同时它还可以利用自噬代谢掉化疗药物产生细胞毒性物质,增强肿瘤的侵袭和转移能力,因此,抑制肿瘤自噬是增强抗肿瘤药物化疗敏感性的重要策略[17-19]。本研究结果显示,褪黑素联合吉西他滨通过抑制LC3-II/LC3-I,增加p62的表达进而抑制细胞自噬,提示褪黑素可能是通过抑制自噬增强吉西他滨化疗作用。

铁死亡是一种铁依赖性的区别于细胞凋亡的死亡方式,其主要是由于细胞膜上过载的脂质过氧化所引起的[20-23]。有研究发现铁死亡与肿瘤细胞耐药性存在一定的联系,可能是通过调控GPX4和xCT系统从而促进肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。GPX4是铁死亡的关键调节因子,它可以将磷脂氢过氧化物转化为相应的磷脂醇,靶向抑制GPX4可以诱导细胞膜脂质过氧化的聚积,从而在体内和体外环境下诱导铁死亡[24]。SLC7A11是xc-系统中的转运蛋白亚基,通过FIN阻断SLC7A11介导的胱氨酸转运能够在许多肿瘤细胞中诱导铁死亡,并增加其化疗敏感性[25]。这些相关基因是肿瘤细胞产生耐药性的重要机制。本研究显示,与吉西他滨组比较,联合用药组的GPX4、SLC7A11的表达均明显下调(P<0.01),提示褪黑素提升化疗敏感性的机制可能与降低铁死亡相关基因(GPX4、SLC7A11)的表达有关。后续还需进一步研究来确定其作用的具体靶点及作用机制。

综上所述,本实验结果证实了褪黑素能够通过抑制细胞自噬及促进铁死亡进而增强胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性。本研究为胰腺导管腺癌的治疗提供了一种潜在的化疗药物组合,并提示靶向开发一种自噬抑制剂及铁死亡诱导剂可能作为增敏吉西他滨化疗敏感性的潜在策略。

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