真核翻译起始因子4G1在老年子宫内膜样癌患者中表达及临床意义

彭秀娟 胡玉红 张丹凤

(佳木斯大学附属第一医院妇产科,黑龙江 佳木斯 154000)

子宫内膜癌(EC)又称子宫体癌,是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一〔1〕。国际癌症机构最新数据显示,2020年,全球EC新发病例417 367例,新增死亡97 370例,且发病率及死亡率逐年上升〔2〕。子宫内膜样癌是EC最常见的病理亚型,约占EC总病例的80%,组织学上多呈绒毛腺管状或腺性内膜样结构,并伴有复杂而密集的分支〔3〕。EC起病隐匿,多数早期患者可通过手术及放化疗获益,预后较好,但晚期及复发性患者的疾病管理与治疗方案选择有限,5年生存率仅为15%～17%〔4〕。真核翻译起始因子(eIF)4G1是翻译起始复合物eIF4F的亚基之一,该因子于1981年由Tahara等〔5,6〕从核糖体盐液的蛋白复合物(eIF4F)中分离得出,并曾被称为P220、eIF4G和eIF4γ。eIF4G1是一种关键的支架蛋白,在蛋白质翻译起始阶段,可作为起始因子及蛋白结合桥梁促进核糖体与mRNA的结合〔7〕。研究表明,eIF4G1可在多种翻译机制和细胞进程中扮演重要角色,与细胞生长、增殖、恶性转化及侵袭密切相关,是肿瘤诊断及治疗的潜在靶标〔8,9〕。既往研究证实,eIF4G1过表达可参与多种肿瘤的发生发展,如肺癌、前列腺癌、乳腺癌和鼻咽癌等,并与患者的不良预后紧密相关〔10,11〕。然而,eIF4G1在子宫内膜样癌中的表达、临床意义及作用机制尚未见相关报道。因此,本研究旨在分析eIF4G1在子宫内膜样癌与癌旁组织中的表达,同时进一步探讨其与患者临床病理特征之间的关系,以阐明eIF4G1在子宫内膜样癌疾病诊断及病情评估中生物标志物的潜在临床价值。

1.1一般资料 收集佳木斯大学附属第一医院妇科2019年1月至2023年8月诊治的62例子宫内膜样癌组织蜡块标本。平均年龄(57.08±7.91)岁。根据国际妇产科联盟(FIGO,2009年)分期:Ⅰ期35例,Ⅱ～Ⅲ期27例。收集同期行诊刮术或子宫切除术的26例正常子宫内膜组织、30例非典型增生子宫内膜组织作为对照组。正常子宫内膜组:年龄44～72岁,平均(54.00±6.79)岁;非典型增生子宫内膜组:年龄41～73岁,平均(55.47±8.29)岁。3组年龄差异无统计学意义(F=1.53,P=0.22)。另选取同期-80 ℃冻存的20例新鲜子宫内膜样癌组织及癌旁3 cm正常组织进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western印迹检测,患者年龄43～76岁,平均(58.35±8.22)岁。纳入标准:①符合WHO子宫体肿瘤分类(2020年)中子宫内膜样癌的诊断标准,且经组织病理学证实;②临床资料完整;③术前未接受过放化疗或靶向治疗等相关治疗。排除标准:①合并凝血功能障碍;②合并重要脏器功能不全;③合并免疫系统疾病或严重感染。本研究经医院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。

1.2实验试剂 免疫组化PV-6000、乙二胺四乙酸(EDTA)修复液和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自中杉金桥生物有限公司(中国),兔抗人eIF4G1多抗、β-actin抗体购自Proteintech公司(美国),放射免疫沉淀(RIPA)总蛋白裂解液购自代轩生物科技有限公司(中国),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购于碧云天生物技术有限公司(中国),PCR引物由捷瑞生物工程有限公司(中国)合成,Trizol总RNA抽提试剂盒购自Invitrogen公司(美国)。

1.3免疫组化实验 采用免疫组化PV-6000法检测组织中eIF4G1蛋白表达。组织标本均经10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,4 μm厚度连续切片。切片常规脱蜡、水化,加入3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,再行高压热修复抗原,持续4.0 min。滴加一抗,eIF4G1稀释至1∶200,4 ℃孵育过夜;磷酸缓冲液(PBS)冲洗,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠/兔IgG二抗,在室温下孵育50 min;DAB显色,苏木素复染,梯度酒精进行脱水后封片。以PBS代替一抗作为阴性对照,光镜下观察组织染色情况。

1.4Western印迹检测eIF4G1蛋白表达水平 配制RIPA蛋白裂解液,提取组织总蛋白,BCA定量试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,胶内蛋白转移至0.2 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗eIF4G1(1∶200)、β-actin 4 ℃孵育过夜,Tris盐酸缓冲液 (TBST)洗涤3次后,室温孵育二抗1 h,滴加电化学发光(ECL)显色。β-actin作为内参,用凝胶成像系统分析目的蛋白的相对表达水平。

1.5Real-time PCR实验 采用Real-time PCR对eIF4G1 mRNA进行定量检测。使用Trizol试剂提取30对子宫内膜样癌与癌旁内膜组织总RNA,紫外分光光度计检测其浓度。用逆转录试剂盒生成cDNA,按Real-time PCR试剂说明书进行PCR,β-actin基因作为内参。PCR体系:上、下游引物各0.4 μl,DNA模板2.0 μl,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μl,添加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至总体积20 μl。反应条件:95 ℃预变性60 s;95 ℃ 15 s,60 ℃退火延伸34 s,循环40次。Primer Premier5软件设计eIF4G1引物,eIF4G1上游序列:5′-TATTCCAGCCAACTTGTCTC-3′,下游:5′-CAACAGCCTCCTTCTTATTTAG-3′;β-actin上游:5′-AAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′,下游:5′-TGTGTGGACTTGGGAGAGG-3′。比较eIF4G1 mRNA表达差异,相对表达倍数用2-ΔΔCt值表示。

1.6染色结果判定 两位主治及以上职称的病理科医师以双盲方式进行切片判读,eIF4G1阳性表达定位为细胞质,表现为棕黄色或黄褐色颗粒。每张切片将随机选择5个高倍视野(×400),计数每个视野中的200个细胞,细胞的染色强度和密度将作为评分标准。①细胞染色强度评分:0分(无染色或染色不清)、1分(浅黄色)、2分(棕黄色)、3分(深褐色)。②阳性细胞百分比评分:无阳性细胞为0分,阳性细胞数25%≤为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。将阳性细胞染色强度评分与表达百分比相乘:0～3分为阴性(-),>3分为阳性(+)。

1.7统计学分析 采用SPSS26.0软件进行χ2检验、t检验,使用Graphpad Prism7.0绘图。

2.13组子宫内膜组织中eIF4G1蛋白表达 eIF4G1阳性表达定位于细胞质,呈棕黄色或黄褐色颗粒。在正常子宫内膜组、非典型增生子宫内膜组及子宫内膜样癌组eIF4G1阳性表达率分别为19.2% (5/26)、53.3% (16/30)和80.6%(50/62),组间差异具有统计学意义 (χ2=29.614,P<0.05)。正常子宫内膜组阳性率明显低于非典型增生子宫内膜组(χ2=6.912,P<0.05),非典型增生子宫内膜组明显低于子宫内膜样癌组(χ2=7.439,P<0.05),正常子宫内膜组明显低于子宫内膜样癌组(χ2=29.479,P<0.05)。见图1。

图1 eIF4G1在各组子宫内膜组织中表达(PV-6000法,×400)

2.2子宫内膜样癌组织中eIF4G1蛋白表达与临床病理特征的关系 eIF4G1与患者年龄、淋巴结转移及绝经状态无关(P>0.05),与组织分化程度、FIGO分期、肌层浸润深度及脉管癌栓相关,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 子宫内膜样癌患者eIF4G1阳性表达与临床病理资料的相关性〔n(%)〕

2.3子宫内膜组织中eIF4G1蛋白与mRNA表达差异 Real-time PCR检测结果显示,癌组织中eIF4G1 mRNA表达水平(1.84±0.21)明显高于癌旁组织(0.99±0.13;t=12.755,P<0.001)。同时,Western印迹分析eIF4G1在子宫内膜样癌与癌旁组织中的蛋白表达水平提示,在癌组织中,eIF4G1蛋白表达水平(0.44±0.04)明高于对应的癌旁内膜组织(0.26±0.06;t=7.488,P<0.001)。见图2。

图2 Western印迹检测eIF4G1蛋白表达

EC是女性癌症死亡的主要原因之一。不孕症、肥胖、癌症家族史、糖尿病、年龄和雌激素水平升高均被确定为该疾病的重要危险因素〔12〕。近年来,随着EC诊断方式和治疗策略的不断改进,规范的手术、化疗或放疗己成为在早期患者中常用且有效的治疗手段,普遍预后良好,然而,对于晚期及复发型病例,该病的治疗选择仍然有限,需要寻找更有效的临床诊治策略〔13〕。

蛋白质的合成包含4个主要环节:起始、延伸、终止及核糖体回收,其中,起始阶段是其翻译调控的主要靶点及限速步骤〔14〕。eIF4G1是eIF4G家族的主要成员,在真核生物mRNA翻译起始过程中,可作为启动因子与蛋白对接位点,与eIF4A、eIF4E组装形成翻译起始复合物eIF4F,进而调控核糖体亚基与mRNA结合,启动翻译机制〔15,16〕。

肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程,涉及多种因素的协同作用。选择性mRNA翻译和信号传导通路的紊乱被广泛认为是导致细胞分化异常和恶性转变的主要原因〔17,18〕。研究表明,翻译起始因子的功能失调可以促进蛋白质翻译的重编程,进而对细胞的生存、增殖、转移和新生血管形成产生影响〔19,20〕。Silvera等〔21〕在乳腺癌中发现,eIF4G1可对蛋白质合成机制进行重编程,以增加具有内部核糖体进入位点(IRES)的mRNA的翻译,从而促进乳腺癌瘤栓形成和肿瘤细胞存活(如p120 mRNA),沉默eIF4G1可对癌栓形成明显抑制。Li等〔8〕研究也证实,eIF4G1过表达与乳腺癌的预后不良密切相关,是其潜在的预后生物标志物。eIF4G1在非小细胞肺癌(NSCLC)的发病机制中同样发挥重要作用。Del Valle等〔10〕通过免疫组化发现,eIF4G1在NSCLC肿瘤组织中的表达明显高于癌旁及正常组织,并与NSCLC中的PD-1/PD-L1等免疫检查点分子具有显著相关性,应用eIF4G1抑制剂可有效抑制细胞培养和动物模型中 NSCLC的生长。证明了eIF4G1在NSCLC中的临床相关性、免疫调节功能和治疗潜力。Jaiswal等〔22〕在前列腺癌中观察到,eIF4G1的基因表达与PCa肿瘤分级和分期呈正相关,其蛋白过表达亦与肿瘤进展及转移有紧密关系,敲低PCa细胞中eIF4G1可引起细胞周期阻滞、增殖抑制及迁移减少。此外,eIF4G1还被认为参与多种疾病及肿瘤的发生发展,是其病情程度判断及预后评估的重要生物标志物〔22～24〕。然而,eIF4G1在子宫内膜样癌中表达及与临床病理参数的关系仍缺少相关报道。

本研究提示,eIF4G1可能参与调控子宫内膜样癌的发生发展,并与肿瘤的恶性生物学行为相关。eIF4G1因子高阳性表达可能与肿瘤进展、侵袭性增加及不良预后相关。

综上,eIF4G1有望成为子宫内膜样癌临床治疗靶点和早期诊断标志物,并为患者病情和预后评估提供参考依据。但是,本实验也存在不足,如样本数量有限,可能导致实验结果偏差,且该因子在子宫内膜样癌发病中具体作用机制尚未明确,因此,下一步还需扩大样本规模以提高实验结果的统计功效及通过离体和在体实验模型,进一步探索eIF4G1在子宫内膜样癌发生发展中作用及分子机制。

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