斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组及系统发育分析

林兴雨, 宋 南

(河南农业大学植物保护学院,河南 郑州 450002)

蝽总科(Pentatomoidea)是半翅目(Hemiptera)异翅亚目(Heteroptera)蝽次目(Pentatomomorpha)中物种数量最多的一个类群。目前,全世界有18个科1 410个属超过8 000个已知种被描述[1]。蝽总科的大多数昆虫以粮食作物或野生植物为食,有些是农业和林业上重要的经济害虫[2];但有些属于天敌昆虫,在农业生产上被用于害虫的生物防治[3]。

斯氏珀蝽 (PlautiastaliScott, 1874)属于蝽总科蝽科(Pentatomidae),是农业生产上危害较严重的一种昆虫。若虫有5个龄期,整个若虫期约1个月,成虫寿命较长,一般为半个月至1个月,有一定的趋光性,一年发生2代[4-5]。目前,有关斯氏珀蝽的研究较少,主要集中在生物学和昆虫-微生物肠道共生关系方面[5-6]。青革土蝽(MacroscytusjaponensisScott, 1874)属于蝽总科土蝽科(Cydnidae)。有关该虫的研究很少,仅Zhu et al[7]曾对青革土蝽进行了简要描述。由上可知,有关斯氏珀蝽和青革土蝽的分子结构和系统发育关系尚不明确。

昆虫线粒体基因组呈环状双链结构,由37个基因组成,即13个蛋白质编码基因(protein-coding genes, PCGs)、2个核糖体RNA基因(ribosomal RNA genes, rRNAs)、22个转运RNA基因(transfer RNA genes, tRNAs),还有非编码控制区[8-10]。通过研究昆虫线粒体基因组可获得其分子进化的关键信息,如核苷酸组成、密码子的使用频率和进化率等[11]。高通量测序技术的快速发展,使得昆虫线粒体基因组较易通过组装而得到,且因其具有保守的基因排列和母系遗传等优点被广泛用于昆虫的分子进化、生物地理学和系统发育等研究[12-18]。

本研究利用高通量测序技术获得斯氏珀蝽和青革土蝽完整的线粒体基因组数据,并在此基础上构建蝽总科的系统发育树,为更好地理解蝽总科下科级和种级水平的系统发育关系提供依据。

1.1 标本采集与DNA提取

斯氏珀蝽和青革土蝽于2019年7月采集于河南省郑州市人民公园(34°76′N、113°66′E)。将采集到的斯氏珀蝽和青革土蝽浸泡在无水乙醇中,并置于-20 ℃超低温冰箱中备用。使用天根生化科技有限公司的动物基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit, China)提取斯氏珀蝽和青革土蝽样本胸部肌肉的总DNA,按照说明书操作。使用NanoDrop 2000分光光度计和1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳分别检测总DNA的质量和浓度。

1.2 高通量测序与线粒体基因组组装

将质量合格且浓度大于20 ng·mL-1的DNA送至上海派森诺生物科技有限公司,利用全基因组鸟枪法(whole genome shotgun, WGS)构建350 bp的小片段文库,并使用Illumina HiSeq 2500测序平台对构建的文库进行双末端(2×150 bp PE)测序。将下机的原始数据去除接头,进行质量控制,获得clean reads。利用GetOrganelle v1.7.5.2软件[19]对双末端测序获得的clean reads进行组装和拼接,得到高质量的线粒体基因组数据。

1.3 线粒体基因组注释和分析

先在MITOS网站[20]上对斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组数据进行初步的功能注释和tRNAs二级结构预测,具体参数设置:Genetic Code为05-inverterbrate, Reference为RefSeq 63 Metazoa,其余均为默认参数。然后,将斯氏珀蝽和青革土蝽与近缘种的线粒体基因组序列进行比对验证,手动检查、矫正13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs的基因边界。将斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组数据注释后上传至GenBank(GenBank序列号分别为OP919327和OP930890)。利用MEGA 11.0软件[21]计算和分析斯氏珀蝽和青革土蝽线粒体基因组中所有PCGs的核苷酸组成和密码子使用频率的情况。根据AT-skew=(A-T)/(A+T)和GC-skew=(G-C)/(G+C)分别计算它们的AT偏斜和GC偏斜[22]。

1.4 多序列比对

先使用MAFFT软件[23]中的E-INS-I策略对所有PCGs进行序列比对。然后,利用trimAl v1.4软件[24]对质量较差的序列片段进行修剪、删除和对齐。最后,使用FASconCAT-G v1.04脚本[25]串联数据获得数据矩阵。用于系统发育分析的数据矩阵包括:(1)13个PCGs的核苷酸序列构建的数据矩阵;(2)13个PCGs的第1、2密码子的核苷酸序列构建的数据矩阵,因为去除PCGs的第3密码子可以有效减小异质性饱和度对系统发育的不利影响[18];(3)13个PCGs的氨基酸序列构建的数据矩阵。

1.5 系统发育分析

以已经公布线粒体基因组数据的蝽总科9个科[蝽科、龟蝽科(Plataspidae)、盾蝽科(Scutelleridae)、兜蝽科(Dinidoridae)、荔蝽科(Tessaratomidae)、土蝽科、同蝽科(Acanthosomatidae)、异蝽科(Urostylididae)和Megarididae]的113个物种和本研究的斯氏珀蝽和青革土蝽作为内群,2个红蝽总科(Pyrrhocoroidea)物种(Dysdercusevanescens和Pyrrhocoristibialis)作为外群,分别采用最大似然法(maximum likelihood)和贝叶斯法(Bayesian inference)构建系统发育树。利用 IQ-TREE v2.0.6软件[26]对13个PCGs的核苷酸序列构建的数据矩阵和13个PCGs的第1、2密码子的核苷酸序列构建的数据矩阵进行最大似然系统发育分析:由软件自动筛选的最适模型为GTR+F+I+G4,系统发育树的节点支持率通过自举检验置信度进行评估(运行次数设置为10 000次)。使用MrBayes v3.2软件[27]对13个PCGs的氨基酸序列构建的数据矩阵进行贝叶斯系统发育分析:执行4条蒙特卡罗马尔柯夫链(Markov chain Monte Carlo, MCMC),并运行10 000 000代,每运行1 000代抽样一次,每次均丢弃25%的老化树,最后获得多数一致树。

2.1 线粒体基因组分析

利用OGDRAW v1.3.1软件[28]绘制斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组结构图(图1-2)。斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组全长分别为15 346、14 632 bp。斯氏珀蝽的A、T、G、C含量分别为42.20%、32.60%、10.60%、14.60%;青革土蝽的A、T、G、C含量分别为41.10%、31.60%、11.20%、16.00%。由上可知,斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组均具有较高的AT含量。它们的线粒体基因组均包含37个基因(13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs)和1个非编码控制区(表1-2)。

表1 斯氏珀蝽线粒体基因组注释1)Table 1 Annotation of P.stali mitochondrial genome

图1 斯氏珀蝽线粒体基因组结构Fig.1 Structure of P.stali mitochondrial genome

在斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组中,H链(heavy strand)和L链(light strand)的编码基因不同;H链共编码23个基因,包含9个PCGs和14个tRNAs;L链共编码14个基因,包含4个PCGs、8个tRNAs以及2个rRNAs。斯氏珀蝽的非编码控制区处于rrnS和trnI之间,全长为689 bp,A、T、G、C含量分别为34.54%、34.69%、11.32%、19.45%;青革土蝽的非编码控制区在nad4l和trnT之间,长度较短,为68 bp,A、T、G、C含量分别为54.41%、39.71%、1.47%、4.41%。斯氏珀蝽的整个线粒体基因组AT含量为74.80%,AT偏斜和GC偏斜分别为0.128和-0.157(表3);青革土蝽的整个线粒体基因组AT含量为72.70%,AT偏斜和GC偏斜分别为0.130和-0.177(表4)。

2.2 PCGs分析

斯氏珀蝽的13个PCGs中,只有nad2、cox1、nad6和nad1利用ATC或TTG作为起始密码子,其余9个PCGs以ATA、ATT或ATG作为起始密码子;cox1具有不完整的终止密码子T,cox2以TTG作为终止密码子,其余11个PCGs均具有完整的终止密码子TAA或TAG(表1)。青革土蝽的13个PCGs中,只有nad1以GTG作为起始密码子,其余12个PCGs以ATT、ATA或ATG作为起始密码子;5个PCGs(cox1、cox2、atp6、cox3和nad5)具有不完整的终止密码子T或TA,其余8个PCGs均具有完整的终止密码子TAA或TAG(表2)。

表2 青革土蝽线粒体基因组注释1)Table 2 Annotation of M.japonensis mitochondrial genome

表3 斯氏珀蝽线粒体基因组的核苷酸组成和偏斜1)Table 3 Nucleotide composition and skewness of P.stali mitochondrial genome

表4 青革土蝽线粒体基因组的核苷酸组成和偏斜1)Table 4 Nucleotide composition and skewness of M.japonensis mitochondrial genome

斯氏珀蝽和青革土蝽所有PCGs的氨基酸中,丙氨酸(Ala)占42.21%和41.09%,半胱氨酸(Cys)占14.56%和16.04%,甘氨酸(Gly)占10.60%和11.21%,苏氨酸(Thr)占32.61%和31.64%,未发现其他氨基酸。斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组的相对密码子使用频率见表5-6。

表5 斯氏珀蝽线粒体基因组的相对密码子使用频率(RSCU)1)Table 5 Relative synonymous codon usage (RSCU) of P.stali mitochondrial genome

表6 青革土蝽线粒体基因组的相对密码子使用频率(RSCU)1)Table 6 Relative synonymous codon usage (RSCU) of M.japonensis mitochondrial genome

2.3 tRNAs和rRNAs分析

斯氏珀蝽的22个tRNAs的序列长度为63～74 bp。其中:最长的基因是trnK,为74 bp;trnC和trnP最短,均为63 bp(表1)。青革土蝽的22个tRNAs的序列长度为62～72 bp。其中:trnK最长,为72 bp;trnR最短,为62 bp(表2)。斯氏珀蝽和青革土蝽的24个RNA基因中,10个RNA基因位于L链,14个RNA基因位于H链。这两种昆虫的trnS1基因都因缺少二氢尿嘧啶(DHU)臂而无法形成完整的三叶草结构,其余tRNAs均能形成完整的三叶草结构(图3-4)。此外,斯氏珀蝽和青革土蝽的trnS1基因的反密码子不是常见的GCU,而是UCG。

图3 斯氏珀蝽线粒体基因组中22个tRNAs的二级结构Fig.3 Secondary structure of 22 tRNAs in P.stali mitochondrial genome

图4 青革土蝽线粒体基因组中22个tRNAs的二级结构Fig.4 Secondary structure of 22 tRNAs in M.japonensis mitochondrial genome

斯氏珀蝽线粒体基因组中rrnL的全长为1 235 bp(表1),AT含量为77.70%(表3),GC含量为22.30%;rrnS的全长为793 bp(表1),AT含量为76.30%(表3),GC含量为23.70%。青革土蝽线粒体基因组中rrnL的全长为1 271 bp(表2),AT含量为75.80%(表4),GC含量为24.20%;rrnS的全长为802 bp(表2),AT含量为73.60%(表4),GC含量为26.40%。

2.4 系统发育分析

两种系统发育分析方法构建的系统发育树(图5-7)一致支持蝽科、龟蝽科、盾蝽科、兜蝽科、荔蝽科、土蝽科、同蝽科、异蝽科和Megarididae均为单系群。基于13个PCGs的核苷酸序列构建的系统发育树(图5)显示:蝽科与龟蝽科为姐妹群,但节点支持率较低(BS=63);土蝽科与(荔蝽科+兜蝽科)为姐妹群,节点支持率相对较高(BS=93)。基于13个PCGs的第1、2密码子的核苷酸序列构建的系统发育树(图6)显示:蝽科与[盾蝽科+(荔蝽科+兜蝽科)+(同蝽科+土蝽科)]关系较近,但节点支持率较低(BS=58);土蝽科与同蝽科为姐妹群,但节点支持率较低(BS=43)。基于13个PCGs的氨基酸序列构建的系统发育树(图7)显示:蝽科与[(荔蝽科+兜蝽科)+(盾蝽科+土蝽科)]亲缘关系较近,且节点支持率相对较高(PP=0.97);土蝽科与盾蝽科的姐妹群关系被强烈支持(PP=1)。

*表示本研究中的两种昆虫。

*表示本研究中的两种昆虫。

*表示本研究中的两种昆虫。

此外,3个系统发育树均强烈支持:斯氏珀蝽与珀蝽(P.fimbriata)为姐妹群(BS=1,PP=1),青革土蝽与M.subaeneus为姐妹群(BS=1,PP=1)。

本研究使用高通量测序技术获得斯氏珀蝽和青革土蝽的完整线粒体基因组数据。在两种昆虫的线粒体基因组中,大多数PCGs以ATA、ATG或ATT作为起始密码子,但也有一些PCGs未以这些密码子开头,这种现象在其他半翅目昆虫[18,29-31]中也有。同时,大多数PCGs以TAA或TAG作为终止密码子;而斯氏珀蝽的cox1以及青革土蝽的cox1、cox2、atp6、cox3和nad5具有不完整的终止密码子T或TA,这种情况通常被认为是mRNA通过转录后,由开头端的碱基将终止密码子的结尾补充完整。trnS1基因由于缺失DHU臂而无法形成完整的三叶草结构,这种现象在其他半翅目昆虫[32]中也有。此外,斯氏珀蝽和青革土蝽的rrnL和rrnS基因都展示出较高的AT含量(73.60%～77.70%)。

近年来,蝽总科的单系性得到了分子生物学和形态学研究[33-35]的支持,然而它的科级水平的系统发育关系仍然存在争议。例如:Lis et al[36]基于rrnL和rrnS基因通过贝叶斯法分析发现,兜蝽科为单系群,且荔蝽科与盾蝽科为姐妹群;而Wu et al[37]利用贝叶斯法、最大似然法和最大简约法分析发现,蝽科与(同蝽科+澳丝蝽科Lestoniidae)为姐妹群,土蝽科与(荔蝽科+兜蝽科)有较近的亲缘关系。异蝽科与同蝽科的姐妹群关系得到了许多研究[3,18,38-40]的支持。例如,Xu et al[18]基于线粒体的37个基因以及PCGs的第1、2密码子加24个RNA基因的研究结果均支持蝽科与(异蝽科+同蝽科)为姐妹群。

本研究基于测序获得的斯氏珀蝽和青革土蝽的线粒体基因组数据,以及蝽总科9个科的113个物种(内群)和红蝽总科2个物种(外群)的13个PCGs的核苷酸序列,第1、2密码子的核苷酸序列以及氨基酸序列,分别利用最大似然法和贝叶斯法构建了系统发育树。这两种分析结果均强烈支持荔蝽科与兜蝽科亲缘关系较近,与Wu et al[37]和Xu et al[18]的研究结果一致。然而,两种分析结果均不支持异蝽科与同蝽科的姐妹群关系,且蝽科与土蝽科的系统发育关系也不一致。因此,下一步需要通过选取更多的类群以及使用核基因、全基因组等方法更深入地研究蝽总科的系统发育关系。此外,两种分析结果均表明,斯氏珀蝽与珀蝽为姐妹群,青革土蝽与M.subaeneus为姐妹群。

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