基于体外细胞实验和网络药理学探讨槐定碱治疗前列腺癌的作用机制

王 乐,芦春斌

暨南大学生命科学技术学院,广州 510632

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球中老年男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。2020年全球男性新发癌症病例1 006万,死亡病例553万例,其中新发PCa病例141万例,死亡病例38万例,死亡发病比为27%,而中国新发PCa病例12万,死亡病例5万,PCa死亡发病比为41.7%[1]。美国癌症协会2023年研究数据表明,PCa患病率居男性恶性肿瘤第一,约占比29%[2]。目前,临床上治疗PCa的方案主要有雄激素剥夺疗法、根治性前列腺切除术、放化疗以及分子靶向治疗等[3],然而这些治疗手段存在诸多副作用,且药物易产生耐药,造成部分患者预后较差,出现复发或进展[4]。因此,寻找安全有效的PCa治疗新药物具有重要意义。

槐定碱(sophoridine,SRI)主要是从苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)中分离得到的一种四环喹啉西啶生物碱。研究表明SRI具有诸多的药理作用,包括抗炎、抗病毒和抗肿瘤等[5]。2005年,盐酸槐定碱注射液被国家食品药品监督管理局批准用于临床上治疗恶性滋养细胞肿瘤[6]。目前,SRI已被试用于胃肠道肿瘤肝转移的治疗[7],同时大量报道证实SRI对结直肠癌、肺癌、胰腺癌等肿瘤也有较好的抑制作用[8]。然而,SRI对PCa的影响及其可能的作用机制还不清楚。

网络药理学是一门以经典药理学、生物信息学,以及计算机科学等多学科理论为基础的新兴学科,广泛应用于药物开发以及药物作用机理研究。本文通过体外细胞实验研究SRI对DU-145细胞增殖、凋亡的影响,并结合网络药理学和分子对接技术探究其可能的作用机制,以期为SRI临床治疗PCa提供理论依据和数据支撑。

1.1 细胞及来源

DU-145细胞来自暨南大学免疫学系何贤辉课题组惠赠。

1.2 药品与试剂

SRI(批号221116,纯度>98%,成都植标化纯生物技术有限公司);DMEM培养基(批号8122653,美国Gibco公司);胰酶(批号2458323,美国Gibco公司);FBS(批号12A299,上海吉泰依科赛生物科技有限公司);DMSO(批号Y190601,美国MP公司);MTT(批号829Z056,北京索莱宝科技有限公司);结晶紫(批号RS6527B219,上海瑞永生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(批号AK12112,武汉伊莱瑞特生物科技有限公司);AG RNAex Pro RNA提取试剂(批号A4A0616,广州瑞真生物技术有限公司);Evo M-MLV反转录试剂预混液(批号A5A1512,广州瑞真生物技术有限公司);SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(批号A5A2693,广州瑞真生物技术有限公司);Ki67抗体(批号AC220907054,武汉赛维尔生物科技有限公司);FITC标记的山羊抗兔IgG(批号CR2203121,武汉赛维尔生物科技有限公司);β-actin抗体(批号AC230205002,武汉赛维尔生物科技有限公司);GAPDH抗体(批号AC221016006,武汉赛维尔生物科技有限公司);PCNA抗体(批号AC230612023,武汉赛维尔生物科技有限公司);Bax抗体(批号AC230612029,武汉赛维尔生物科技有限公司);p38MAPK抗体(批号1000220-9,艾博抗(上海)贸易有限公司);Anti-active+pro Caspase-3 Antibody(批号H660063003,杭州华安生物技术有限公司);Bcl-2抗体(批号10092580,艾比玛特医药科技(上海)有限公司);p-p38MAPK抗体(批号10049598,艾比玛特医药科技(上海)有限公司);Goat Anti-Rabbit Mouse IgG-HRP(批号10042368,艾比玛特医药科技(上海)有限公司);ECL发光液(批号2207149,美国Millipore公司);预染蛋白marker(10-180 KDa)(批号00785996,基因生物技术国际贸易(上海)有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号B1A9001249,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。

1.3 主要仪器

CCL-170B-8型二氧化碳细胞培养箱(新加坡ESCO公司);Synergy4型多功能酶标仪(美国BioTek公司);CYTOFLEX型细胞分析与检测系统(中国贝克曼库尔特国际贸易有限公司);CFX96型实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司);GeneGoomeHR型化学发光凝胶成像系统(英国Syngene公司);LEICA CW4000型核型分析系统(德国LEICA公司)等。

1.4 工具与数据库

1.4.1 工具

微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn/);Venny2.1.0在线工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/);Cytoscape3.9.0软件;AutoDock1.5.6软件;PyMol软件;ImageJ软件;GraphPad Prism9.0软件等。

1.4.2 数据库

TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/);HERB数据库(http://herb.ac.cn/Detail/?v=HBIN044 394&label=Ingredient);Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/);PharmMapper数据库(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/);Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/#query=Sophoridine);Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/);OMIM数据库(https://omim.org/);GeneCards数据库(https://www.genecards.org/);STRING数据库(https://cn.string-db.org/);DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞培养

DU-145细胞,置于37 ℃、5% CO2培养箱中,用含10% FBS、1%青-链霉素的DMEM培养基进行培养。取对数生长期的细胞进行实验。

1.5.2 MTT法检测SRI对DU-145细胞增殖的影响

SRI用DMEM培养基配成60 mmol/L母液,-20 ℃保存。收集生长良好的DU-145细胞,接种于96孔板,每孔3 000个细胞。将培养板置于培养箱培养24 h后,分别加入0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L的SRI,继续培养24、48 h。移除培养基后向每孔加入无血清培养基100 μL和MTT溶液20 μL,继续孵育4 h后移除培养基,每孔加入DMSO溶液150 μL进行避光摇床震荡10 min,用酶标仪测定在490 nm处的吸光度,并计算细胞增殖抑制率。

1.5.3 克隆形成实验检测SRI对DU-145细胞增殖能力的影响

收集生长良好的DU-145细胞,接种于6孔板,每孔1 000个细胞。培养24 h后,分别加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI处理细胞48 h。之后更换正常的完全培养基,继续培养7 d左右,细胞集落明显形成。4%多聚甲醛室温固定细胞15 min,1×PBS清洗3次,再用0.1%结晶紫溶液染色10 min,1×PBS清洗3次。风干后拍照,使用ImageJ软件对细胞克隆形成数目进行统计与量化。

1.5.4 免疫荧光实验检测SRI对DU-145细胞Ki67蛋白表达的影响

收集生长良好的DU-145细胞,接种于预先放置细胞爬片的24孔板中,每孔1×104个细胞。培养24 h后,分别加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI处理细胞48 h。1×PBS清洗3次,4%多聚甲醛室温固定细胞15 min,1×PBS清洗3次,0.5% Triton100室温通透20 min,1×PBS清洗3次,5% BSA室温封闭1 h,Ki67(1∶1 000)4 ℃孵育过夜,1×PBS清洗3次。二抗(1∶1 000)避光常温孵育1 h,1×PBS清洗3次,DAPI避光孵育5 min,1×PBS清洗3次,载玻片上滴加适量抗荧光淬灭剂,盖上细胞爬片,荧光显微镜观察拍照。使用ImageJ软件对DU-145细胞Ki67蛋白表达情况进行统计与量化。

1.5.5 流式细胞术检测SRI对DU-145细胞凋亡的影响

收集生长良好的DU-145细胞,接种于6孔板中,每孔2×105个细胞。培养24 h后,分别加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI处理细胞48 h。收集培养基和细胞,低速离心弃上清,加入500 μL 1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞,再加入5 μL Annexin V-FITC Reagent和5 μL PI Reagent,轻轻混匀,避光孵育15 min,上机检测。

1.5.6 网络药理学预测SRI治疗PCa的作用机制

通过TCMSP、HERB、PharmMapper和Swiss Target Prediction数据库收集SRI的药理靶点。首先,在TCMSP数据库和HERB数据库输入SRI的英文名称,收集药理靶点。然后,通过PubChem数据库获得SRI的二维结构和Canonical SMILES。将SRI的二维结构上传到PharmMapper数据库,设置选择目标集:仅限人类蛋白质目标,筛选SRI作用靶点(Z值>0)。同时,将SRI的Canonical SMILES导入Swiss Target Prediction数据库,并选择“智人”作为物种,筛选SRI作用靶点(Probably值>0)。接下来,通过UniProt数据库对收集的SRI靶点进行注释。最后,将来自TCMSP、HERB、PharmMapper和Swiss Target Prediction四个不同数据库的数据集进行合并,删除重复靶点。

以“Prostate cancer”为关键词,在GeneCards(“相关性评分”>10)、OMIM数据库中进行检索PCa靶点。将来自GeneCards、OMIM数据库的数据集进行合并,剔除重复靶点。在Venny2.1.0在线工具中分别导入SRI与PCa的作用靶点,绘制韦恩图,可得到SRI与PCa的共同作用靶点。

使用STRING数据库构建PPI网络。将SRI与PCa的共同作用靶点上传到STRING数据库中,物种选择Homo sapiens,设置最低交互分数大于0.4,其他参数保持默认设置。然后,我们选择“隐藏网络中断开连接的节点”来更新PPI网络,结果保存TSV格式文件。运行Cytoscape3.9.0软件,导入TSV格式文件,使用CytoNCA插件进行网络拓扑学分析,获得各靶点之间的关联度(degree值),并根据蛋白关联度进行排序。最后,degree值排名前10的靶点确定为关键靶点。

使用DAVID数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。将SRI与PCa的共同作用靶点导入DAVID数据库中,默认DAVID数据库参数设置。GO富集分析包括生物学过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)三部分。GO和KEGG分析都应用P<0.01作为截止值,以在每个类别中选择高度显著的富集项。根据富集靶点的数量进行排序,并使用微生信在线平台进行绘制KEGG气泡图和GO生物学过程图。

1.5.7 分子对接

在PubChem数据库获得SRI二级结构文件,导入Chem3D软件,转化为3D结构,并进行能量最小化,导出mol2格式文件,命名SRI.mol2。SRI结构文件导入AutoDock1.5.6软件,进行加氢、计算电荷处理后,设置为配体。在PDB数据库下载p38MAPK晶体结构(ID:2FSL),将p38MAPK晶体结构导入PyMol软件,进行去水、去配体处理,然后在AutoDock1.5.6软件中进行加氢处理,设置为受体。将处理后的p38MAPK、SRI文件导入AutoDock1.5.6软件,采用盲对接方式,保存对接盒子参数。接着运行autogrid4,保存dock.dpf文件,最后运行autodock,设置半柔性对接,对接次数50次,结合能判断分子与蛋白的结合程度,再使用PyMol软件进行结果可视化。

1.5.8 qPCR检测相关基因的mRNA表达水平

收集生长良好的DU-145细胞,接种于6孔板中,每孔2×105个细胞。培养24 h后,分别加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI处理细胞48 h。使用AG RNAex Pro RNA提取试剂提取总RNA,所提取的总RNA用Nano定量,A260/A280>1.8,以随机引物进行逆转录合成cDNA于-80 ℃下保存。qPCR引物由生工生物合成,引物序列见表1。qPCR条件为95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s,共40个循环。

表1 qPCR引物序列

1.5.9 Western blot检测相关蛋白的表达

收集生长良好的DU-145细胞,接种于6孔板中,每孔2×105个细胞。培养24 h后,分别加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI处理细胞48 h。细胞裂解液冰上提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳,转至0.22 μm PVDF膜,5% BSA室温封闭1 h,一抗:GAPDH(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)、p38MAPK(1∶2 000)、p-p38MAPK(1∶2 000)、Anti-active+pro Caspase-3 Antibody(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、PCNA(1∶2 000),4 ℃冰箱孵育过夜。次日,1×TBST洗膜30 min,每次10 min,用二抗(1∶5 000)室温孵育1 h,1×TBST洗膜30 min,每次10 min。ECL发光液显色后,凝胶成像系统拍照,ImageJ软件分析量化各条带灰度值。

1.5.10 统计学分析

2.1 SRI抑制DU-145细胞增殖

为了探究不同浓度SRI对DU-145细胞增殖能力的影响,首先采用MTT实验来确定半数有效抑制浓度IC50。结果显示,与对照组相比,SRI能明显抑制DU-145细胞的增殖能力,SRI作用24、48 h的IC50分别为2.47±0.45、1.41±0.17 mmol/L(见图1)。根据MTT实验结果,后续实验分别用浓度为0.35、0.7和1.4 mmol/L的SRI处理DU-145细胞48 h。克隆形成实验结果显示,SRI处理48 h后,与对照组相比,SRI组能明显抑制DU-145细胞集落形成(见图2)。Ki67免疫荧光实验结果显示,SRI组DU-145细胞中Ki67蛋白的表达较对照组降低(见图3)。qPCR实验结果表明,与对照组相比,增殖相关基因PCNA、Ki67的mRNA表达水平下调(见图4)。同时Western blot结果也证实PCNA蛋白表达水平下降(见图5)。以上结果均表明SRI能抑制DU-145细胞的增殖。

图1 不同浓度槐定碱对DU-145细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentrations of SRI on DU-145 cell proliferation

图2 槐定碱对DU-145细胞克隆形成能力的影响Fig.2 Effect of SRI on the clone-forming ability of DU-145 cells

图3 槐定碱对DU-145细胞Ki67蛋白表达的影响Fig.3 Effect of SRI on Ki67 protein expression in DU-145 cells

图4 槐定碱对DU-145细胞Ki67、PCNA mRNA表达的影响Fig.4 Effect of SRI on Ki67 and PCNA mRNA expression in DU-145 cells

图5 槐定碱对DU-145细胞PCNA蛋白表达的影响Fig.5 Effect of SRI on PCNA protein expression in DU-145 cells

2.2 SRI促进DU-145细胞的凋亡

为了研究SRI对DU-145细胞凋亡的影响,首先采用流式细胞凋亡实验来检测细胞的凋亡情况。SRI处理48 h后,相比于对照组,随着SRI浓度增加,DU-145细胞凋亡率逐渐增加,提示SRI能诱导DU-145细胞发生明显凋亡(见图6)。qPCR实验结果表明,与对照组相比,凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-7 mRNA表达水平上调,Bcl-2 mRNA表达水平下调,Bax mRNA表达水平也有所降低,但Bcl-2/Bax mRNA表达水平比值是明显降低的(见图7)。同时Western blot结果也表明cleaved Caspase-3+pro Caspase-3的蛋白表达水平上调,Bcl-2蛋白表达水平下调,Bax蛋白表达水平有上调趋势,无显著性差异,Bcl-2/Bax蛋白表达水平比值是明显降低的(见图8),表明SRI能促进DU-145细胞的凋亡。

图6 槐定碱对DU-145细胞凋亡的影响Fig.6 Effect of SRI on apoptosis of DU-145 cells

图7 槐定碱对DU-145细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响Fig.7 Effect of SRI on the mRNA expression of apoptosis-related genes in DU-145 cells

图8 槐定碱对DU-145细胞凋亡相关蛋白表达的影响Fig.8 Effect of SRI on the expression of apoptosis-related proteins in DU-145 cells

2.3 网络药理学分析

2.3.1 获取SRI与PCa的共同靶点

为了研究SRI是如何影响DU-145细胞的增殖与凋亡,本研究利用网络药理学来初步研究其作用机制。首先获取SRI的作用靶点,通过检索和收集,在HERB数据库收集到4个,TCMSP数据库收集到2个,PharmMapper数据库收集到68个,Swiss Target Prediction数据库收集到56个,去重后得到127个SRI药理靶点。在GeneCards数据库中共收集到2 092个靶点,OMIM数据库中共收集447个靶点,去重后得到2 407个PCa治疗靶点。将以上收集的SRI靶点通过Venny2.1.0韦恩图工具映射至PCa的靶点中,获得60个药物-疾病共同靶点(见图9)。

图9 槐定碱与前列腺癌共同靶点韦恩图Fig.9 Venn diagram of SRI and PCa common targets

2.3.2 PPI网络分析

本研究利用STRING数据库进行PPI网络分析,绘制PPI分析网络图(见图10)。PPI网络分析得出,该网络共有60个节点,410条边,平均节点degree值:13.7,PPI富集P值<1.0e-16。根据degree值排序,degree值前10的靶点作为核心靶点,分别是ALB、TNF、IL6、CASP3、MAPK1、PPARG、MDM2、PGR、MAPK8、NR3C1、ABL1、MAPK14、PARP1、HDAC2、CDK2、GSK3B(见图10)。

图10 关键靶点蛋白PPI分析Fig.10 PPI analysis of key target protein

2.3.3 GO与KEGG富集分析

本研究利用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。GO分析富集得到158个条目(P< 0.01),其中BP涉及基因表达的正向调节、RNA聚合酶II启动子的转录、细胞凋亡过程、蛋白质磷酸化等,CC涉及细胞质、细胞核、核质等,MF涉及蛋白质结合、ATP结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性和锌离子结合等。图11展示了GO富集分析每一类别富集靶点数目前10的条目。KEGG分析富集得到84个条目(P< 0.01),包括癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、癌症中的蛋白聚糖、MAPK信号通路等。根据富集靶点数目进行排序,选择前10个条目绘制KEGG气泡图(见图12)。SRI可以通过MAPK信号通路影响PCa细胞的增殖、凋亡。

图11 GO富集分析条目条形图(前10)Fig.11 Bar chart of GO enrichment analysis items (top 10)

图12 KEGG通路富集分析气泡图(前10)Fig.12 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis (top 10)

2.4 SRI通过上调p38MAPK的表达影响PCa DU-145的增殖与凋亡

使用分子对接技术进行分析SRI与p38MAPK蛋白的相互作用,发现SRI可以与p38MAPK蛋白(ID:2FSL)的ASP-88残基形成氢键,且结合能是-6.83 kcal/mol(<-5 kcal/mol),说明SRI与p38MAPK蛋白能稳定结合(见图13)。本研究进一步检测DU-145细胞中p38MAPK的mRNA表达水平,p38MAPK、p-p38MAPK的蛋白表达水平。结果显示随着SRI作用浓度的增加,p38MAPK的mRNA表达水平发生上调(见图14),p-p38MAPK蛋白表达水平发生上调,p38MAPK蛋白表达水平无明显变化趋势,p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达水平比值增高(见图15)。提示SRI通过激活p38MAPK来抑制DU-145细胞增殖并促进其凋亡。

图13 槐定碱与核心靶点p38MAPK(ID:2FSL)分子对接Fig.13 Molecular docking of SRI with the core target p38MAPK (ID:2FSL)

图14 槐定碱对DU-145细胞p38MAPK mRNA表达的影响Fig.14 Effect of SRI on p38MAPK mRNA expression in DU-145 cells

图15 槐定碱对DU-145细胞p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达的影响Fig.15 Effect of SRI on the expression of p38MAPK and p-p38MAPK proteins in DU-145 cells

PCa是中老年男性中最常见的恶性肿瘤,容易产生耐药和转移,导致预后较差、复发率高[9],因此,寻求治疗PCa新疗法变得非常迫切。中药的天然化学活性成分在恶性肿瘤的预防和治疗中发挥着重要作用[10]。SRI主要是从中药苦豆子中分离的一种活性生物碱,具有多种药理活性,其中抗肿瘤活性尤为突出。2005年,盐酸槐定碱注射液被中国食品药品监督管理局批准为抗癌药物[6]。SRI在体内和体外对胃癌、肝癌、肺癌、结肠直癌、胰腺癌等多种肿瘤都表现出良好的抗肿瘤作用[8]。SRI可抑制多种肿瘤细胞的增殖和侵袭、促进癌细胞的凋亡和自噬。其作用与PI3K/AKT、Wnt/B-catenin、MAPK/ERK和细胞周期等通路有关[11]。就目前研究而言,SRI对PCa的作用及其确切机制仍不完全清楚。本研究通过体外细胞实验、网络药理学以及分子对接技术,探讨SRI治疗PCa的分子机制,为其临床应用提供一定的研究基础和理论依据。

高增殖率是恶性肿瘤细胞无限生长的一个重要特征,因此抑制细胞增殖是治疗癌症的有效策略[12]。在本研究中,通过检测细胞活力、细胞克隆形成发现随着SRI作用浓度的增加,DU-145细胞的生长受到明显抑制,说明SRI具有抑制DU-145细胞增殖的能力。增殖细胞核蛋白Ki67、PCNA是一种细胞增殖的标记蛋白,通常用作癌症诊断和治疗的预测和预后标记物[13]。本研究通过免疫荧光以及qPCR检测Ki67在DU-145细胞中的表达,发现SRI能明显抑制Ki67的表达,qPCR以及Western blot检测发现SRI能明显降低DU-145细胞中PCNA的表达,更进一步证明SRI对DU-145细胞具有抑制增殖的能力。

细胞凋亡是肿瘤细胞死亡的主要原因,因此,逃避细胞凋亡会导致肿瘤治疗产生抗性[14]。Bcl-2作为凋亡抑制因子在细胞凋亡的调控中起决定性作用[15]。Bax是Bcl-2的同源缀合配偶体,是一种促凋亡蛋白,Bcl-2与Bax的比值是衡量细胞凋亡效应的重要指标[16]。Caspase-3和Caspase-7是细胞凋亡的执行者,当细胞凋亡发生时,Caspase-3和Caspase-7依次被上游Caspase蛋白裂解并激活。然后,激活的Caspase-3和Caspase-7会切割多种下游底物,最终引发凋亡级联反应[17]。本研究通过流式细胞实验检测SRI处理48 h后DU-145细胞凋亡情况,结果表明SRI能明显促进DU-145细胞的凋亡。因此,我们进一步检测了凋亡相关因子的表达情况。qPCR结果表明,SRI能上调Caspase-3、Caspase-7的mRNA表达,下调Bcl-2的mRNA表达,Bax的mRNA表达水平也有所下调,但Bcl-2/Bax的比值是显著降低的(P<0.05)。此外,Western blot结果表明SRI能上调cleaved-Caspase-3蛋白表达,下调Bcl-2的蛋白表达,虽然Bax蛋白表达的上调没有显著性差异,但Bcl-2/Bax的蛋白表达比值明显降低(P<0.05)。这些结果提示SRI可以调控凋亡相关因子的表达,激活凋亡信号通路,诱导DU-145细胞发生凋亡。

此外,为了研究SRI影响DU-145细胞增殖凋亡的作用机制,本研究通过网络药理学研究手段进行分析。我们通过HERB、TCMSP、PharmMapper、Swiss Target Prediction数据库共收集到127个SRI作用靶点,通过Venny2.1.0在线工具获得60个SRI作用于PCa的共同靶点,通过PPI网络分析得到ALB、TNF、IL6、CASP3、MAPK1、PPARG、MDM2、PGR、MAPK8、NR3C1、ABL1、MAPK14、PARP1、HDAC2、CDK2、GSK3B等16个核心靶点(degree值前10)。其中MAPK8、CASP3、MAPK1、MAPK14、TNF核心靶点富集到MAPK信号通路中。GO富集分析得到158个条目(P< 0.01),结果显示SRI可能主要通过调节基因表达、细胞凋亡过程、蛋白质磷酸化以及蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等方面发挥治疗PCa的作用。KEGG通路富集分析结果显示癌症信号通路、癌症中的蛋白聚糖、MAPK信号通路、化学癌变-活性氧、PI3K-AKT信号通路、凋亡等84个信号通路(P< 0.01)。其中最令人关注的是MAPK信号通路在SRI抗PCa过程中发挥的作用。分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)可将细胞外信息传递至细胞核中,在生理及病理过程中发挥重要的作用。哺乳动物细胞中存在3类MAPK家族成员:细胞外信号调节激酶(ERK)、c-JunN-末端蛋白激酶/应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK,也称MAPK14)[18]。

p38MAPK是一种应激活化蛋白激酶,参与细胞增殖、分化、凋亡等众多生物学进程,其激活后能发挥抑制细胞增殖,促进凋亡的作用[19]。研究发现,p38通路激活后可降低BGC-823胃癌细胞的增殖活力,使细胞阻滞于G2/M期[20]。激活p38MAPK,可抑制SMMC-7721细胞增殖,并启动细胞内Caspase信号级联最终诱发凋亡[21]。此外,有研究表明中药提取物可以激活p38MAPK,触发Caspase介导的凋亡级联反应,诱导Lewis肺癌细胞以及HSC-3、SCC-9口腔癌细胞发生凋亡[22,23]。p38MAPK激酶在PCa的发生和发展过程中也起到重要作用。研究发现,在前列腺上皮的恶性转化或骨转移性前列腺癌中,激活p38MAPK能抵抗细胞增殖,促进凋亡以及肿瘤休眠[24,25]。同时其他研究表明,多西他赛、熊果酸等成分能增加p38MAPK的磷酸化水平,诱导PCa细胞发生衰老,抑制PC-3、22Rv1等多种PCa细胞的增殖,并促进其凋亡[26,27]。因此本研究重点关注了p38MAPK蛋白激酶在SRI抗PCa中发挥的作用。利用分子对接技术验证SRI与p38MAPK蛋白的结合情况,结果显示SRI与p38MAPK蛋白能稳定结合,结合能是-6.83 kcal/mol。p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表达水平检测结果表明SRI能激活p38MAPK蛋白,p38MAPK蛋白磷酸化水平发生上调,提示SRI可以通过激活p38MAPK蛋白,诱导凋亡途径发挥抗PCa的作用。

综上,SRI能抑制DU-145细胞的增殖,并促进其凋亡,这可能与其对p38MAPK的激活作用有关。然而本研究仅探讨SRI在体外对DU-145细胞的影响,下一步将进行体内动物实验,进一步深入研究SRI抗PCa的作用机理。

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