犊牛源益生菌的分离鉴定及生物学特性分析

冯鸣鹊，靳天雄，刘 蓓，苏娅澜，仝静迪，赵 岩，程 佳，刘明超

（河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001）

益生菌被定义为“当摄入足够量时，可以为宿主带来益处的活微生物”［1］。益生菌定植于宿主体内可起到多种有益作用，包括抑制病原菌及条件致病菌的生长、激发机体非特异性免疫、增强宿主黏膜免疫能力、提高营养物质吸收、改善机体健康状况以及参与肠-脑轴调节［2］。犊牛腹泻是一种在养牛业中极为常见的疾病，因该病在犊牛群中的发病率和死亡率极高，且病因复杂，被认为是肉牛和奶牛养殖过程中的一大难题。引发犊牛腹泻的原因主要包括大肠杆菌、轮状病毒、冠状病毒和隐孢子虫等病原微生物，以及营养、环境和饲养管理等外部因素。大肠杆菌（Escherichia coli）引起的犊牛腹泻的发病率和死亡率很高，并且在牛群中传播迅速［3］。多项研究发现，从腹泻犊牛粪便样本中分离出的大肠杆菌对多种抗生素耐药的情况已经十分严峻［4-6］。许多研究表明，益生菌可以作为抗生素替代品，不仅能够解决病原菌耐药和药物残留问题，还可以有效防治多种疾病［7］。

机体内的大部分益生菌定植于肠道中，维持肠道菌群稳态，促进营养物质的吸收，减少腹泻的发病率。在畜牧养殖业中，益生菌替代抗生素预防和治疗由于大肠杆菌感染引起的新生仔畜腹泻的潜力已经得到充分证实［8］。有报道称从健康犊牛的肠道微生物群中分离出的4 株乳酸菌对犊牛腹泻常见的病原菌如大肠杆菌K88 和伤寒沙门氏菌等都具有抗菌活性［9］。张学燕等［10］从牦犊牛胃肠道内容物中分离出的乳酸片球菌、罗伊乳杆菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有较强抑制作用，并且对胃肠道环境具有良好的耐受性，可以作为牦犊牛益生菌制剂的添加对象。本研究旨在从健康犊牛粪便中分离并筛选出对大肠杆菌具有抑制作用的益生菌株，为防治大肠杆菌导致的犊牛腹泻提供安全高效、无残留污染的绿色微生物制剂，同时为进一步研究和开发用于防治细菌性犊牛腹泻的微生态制剂奠定基础。

1.1 材料

试验所涉及样品均采集自定州市某奶牛养殖场10 头2 ～14 日龄的健康犊牛。大肠杆菌O111:K58（B4）（菌株编号：CVCC1450）和鼠李糖乳杆菌GR-1（菌株编号：ATCC55826）均由中国农业大学动物医学院临床营养与免疫实验室惠赠；
大肠杆菌K99 从腹泻犊牛粪便中分离；
金黄色葡萄球菌（菌株编号：CVCC186158）购自广州徕智生物科技有限公司；
MRS 和LB 培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司；
哥伦比亚血琼脂培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；
DNA 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；
庆大霉素、青霉素及四环素等10 种药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司；
蛋白酶K 和过氧化氢酶购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 样品采集

挑选2 ～14 日龄生长状态良好、不腹泻、未用药的犊牛，使用无菌棉拭子采取直肠内的粪便样本，置于装有MRS 肉汤培养基的采样管中，封闭管口，标记采样犊牛编号和日期，立即带回实验室进行后续处理。

1.3 细菌的分离与纯化

将装有样本的采样管置于37 ℃恒温培养箱中培养3 h，然后取100 μL 涂布于MRS 琼脂培养基上，在37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h。用接种环挑取平板上生长的单个菌落划线接种于MRS 琼脂培养基上，连续纯化培养，直至平板上的菌落形态、大小、颜色相似。

1.4 形态特征观察

挑取单个菌落进行涂片并进行革兰氏染色，光学显微镜下观察细菌形态和染色特性。

1.5 菌种鉴定

挑取纯化后的单菌落接种于MRS 肉汤培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中扩增培养24 h。

按照细菌DNA 提取试剂盒说明书提取 细 菌DNA，采 用 细 菌16S rDNA 通 用引 物 进 行PCR 扩 增，通 用 引 物：27 F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492 R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR 扩增 体 系25 μL：ddH2O 8.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL。PCR反应体系：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；
72 ℃延伸10 min。将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察分析条带。将有条带的PCR 产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序结果与NCBI 数据库进行BLAST 比对分析。

1.6 抑菌活性的测定

将病原指示菌（大肠杆菌O111:K58（B4）、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K99）接种于LB 肉汤培养基中，置于37 ℃恒温摇床中180 r/min 扩增培养12 h；
将初筛菌株接种于MRS 肉汤培养基中置于37 ℃恒温培养24 h 后，将待测菌悬液12 000 r/min离心20 min，备用。

使用双层平板法进行抑菌实验，配置2%的琼脂溶液和LB 营养琼脂培养基，高压灭菌后将琼脂按每皿10 mL 倒入培养皿中，待LB 营养琼脂培养基冷却至50 ℃左右加入1%的病原指示菌（调节菌液浓度为1×106CFU/mL）。在凝固后的琼脂表面摆放牛津杯，并倒入加入病原指示菌的培养基，待培养基冷却后拔出牛津杯，于各孔中加入200 μL 待测益生菌上清液，以鼠李糖乳杆菌GR-1 为阳性对照，阴性对照组加入200 μL 无菌MRS 培养基，将平板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察抑菌圈情况。

1.7 主要抑菌物质的分析

配置1 mol/L 的NaOH 溶液、1 mg/mL 蛋白酶K和5 mg/mL 的过氧化氢酶溶液，备用。

根据1.6 中提到的方法获得待测菌液上清，分别使用NaOH 溶液（使用NaOH 溶液将待测菌液上清液的pH 调整为7.0）、蛋白酶K（在待测菌液上清中加入1 mg/mL 蛋白酶K，37 ℃水浴处理3 h）和过氧化氢酶溶液（在待测菌液上清中加入5 mg/mL的过氧化氢酶，37 ℃水浴处理1 h）对待测菌液上清进行处理，以消除有机酸、细菌素及过氧化氢对待测菌株抑菌能力的影响。以大肠杆菌K99 作为指示菌，以未处理的益生菌培养上清为对照，用双层平板法分析待测菌株的主要抑菌物质。

1.8 生长特性

将初筛菌株在MRS 固体培养基上活化后，挑取单菌落接种于MRS 肉汤培养基中置于37 ℃恒温箱中培养24 h，然后以1%的接种量接种于新鲜MRS肉汤培养基中37 ℃恒温培养，每隔2 h 用分光光度计在600 nm 处检测其OD 值，每次测定前用涡旋振荡器摇匀，共测量0 ～24 h 内的OD 值，记录数据，以时间为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。

1.9 产酸能力

将初筛菌株在MRS 固体培养基上活化后，挑取单菌落接种于MRS 肉汤培养基中置于37 ℃恒温箱中培养24 h，然后以1%的接种量接种于新鲜MRS肉汤培养基中37 ℃恒温培养，使用pH 计每隔2 h测定各管中益生菌菌液的pH 值，以时间为横坐标，pH 值为纵坐标，绘制菌株的产酸能力曲线。

1.10 益生菌对Caco-2 细胞的黏附能力

将待测菌株接种于MRS 肉汤培养基中置于37 ℃恒温培养24 h，将待测菌悬液4 000 r/min 离心10 min 收集菌体，然后使用无菌PBS 洗涤3 次，将菌体重悬于不含胎牛血清的DMEM 基础培养基中并调节浓度为1×108CFU/mL。

将稳定传代的Caco-2 细胞以5×105cell/孔接种于24 孔板中，在37 ℃、CO2含量为5%的环境下培养，待细胞长成致密单层后，用无菌PBS 洗涤2 次，对照孔中加入1 mL 不含胎牛血清的DMEM基础培养基，试验组每孔加入1 mL 上述菌悬液，在37 ℃、CO2含量为5%的环境下共同孵育2 h。用无菌PBS 轻轻洗涤5 次除去未黏附于细胞上的细菌，再用细胞刮板收集孔中内容物，进行梯度稀释，选择合适的稀释倍数进行平板计数。同时将对照孔中的细胞用0.25%胰酶-EDTA 消化3 min，使用细胞计数器计数。按下列公式计算：

1.11 耐受性检测

1.11.1 耐胆盐 用牛胆盐配制胆盐浓度为0.3%（w/v%）的MRS 肉汤，121℃高压灭菌20 min，冷却，分装后备用。将待测菌液以5%接种量接种至胆盐溶液中，以普通MRS 肉汤培养基作为对照。37 ℃恒温培养箱中培养6 h，然后使用分光光度计在600 nm处检测不同菌液的吸光度，按下列公式计算存活率：

1.11.2 耐人工胃肠液 人工胃液：配置pH3.0 的MRS 肉汤，经高压蒸汽灭菌后冷却至室温，在超净台中无菌加入1 mg/mL 胃蛋白酶，4 ℃保存备用。

人工肠液：配置pH=8.0 的MRS 肉汤，经高压蒸汽灭菌后冷却至室温，在超净台中无菌加入1 mg/mL胰蛋白酶（1∶250），4 ℃保存备用。

将待测菌液以5%接种量接种至人工胃液和人工肠液中，以普通MRS 肉汤作为对照。37 ℃恒温培养箱中培养4 h，然后使用分光光度计在600 nm处检测不同菌液的吸光度，计算存活率。

1.12 抗生素敏感性试验

采用药敏纸片琼脂扩散法测定菌株对抗生素的敏感性。将待测菌株接种于MRS 肉汤培养基中置于37 ℃恒温培养24 h，调整菌液浓度为1.5×108CFU/mL，均匀涂布于MRS 平板培养基上，放置片刻待平板干燥后，将药敏纸片贴于平板上，用镊子轻轻按压防止脱落。将平板放入37 ℃恒温培养箱内培养24 h，测定抑菌圈直径。

1.13 溶血试验

将待测菌株划线接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，以金黄色葡萄球菌为阳性对照，观察有无溶血圈产生。

1.14 统计分析

用SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析（One Way ANOVA），LSD法进行组间多重比较，结果用“平均值 ± 标准误”表示，用GraphPad Prism 8 软件对数据进行作图。P＜ 0.05 表示差异性显著，P＜ 0.01表示差异性极显著。

2.1 益生菌的分离培养及形态学观察

经分离纯化最终从10 头健康犊牛粪便样本中分离得到4 株益生菌株，分别命名为12、14、26、30号菌株。分离的菌株经纯化后，菌落大小均一。菌落MRS 培养基上呈乳白色或透明圆形菌落，表面光滑，凸起，边缘整齐，大小均一。镜检观察发现，菌株为革兰氏阳性菌，菌体形态为短杆状、长杆状或球状（图1）。

图1 益生菌株的形态特征Fig.1 The morphological characteristics of probiotic strains

2.2 16S rDNA 测序鉴定

将16S rDNA 测序结果在NCBI 网站经BLAST比对分析，结果如表1 所示，12 号菌株与敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilis）的序列相似性为99.85%，14号菌株与戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的序列相似性分别为99.89%，26 号菌株与唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）的序列相似性为100%，30 号菌株与约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）的序列相似性为99.87%。

表1 益生菌株16S rDNA 序列比对结果Table 1 Sequence alignment of 16S rDNA of probiotic strains

2.3 抑菌活性的测定

以大肠杆菌O111:K58（B4）、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K99 为病原指示菌，以鼠李糖乳杆菌GR-1 为对照，通过双层平板法对分离得到的4 株益生菌进行抑菌试验，结果如表2 所示，4 株益生菌对3 种病原指示菌的抑菌圈均直径 ＞ 15 mm，认为4 种菌株都具有较强的抑菌活性，其中14 号菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径小于标准株鼠李糖乳杆菌GR-1（P＜ 0.05），其余益生菌与标准株鼠李糖乳杆菌GR-1 对3 种病原指示菌的抑菌圈直径不具有显著差异（P＞ 0.05）。

表2 益生菌培养上清对不同病原指示菌的抑菌活性Table 2 The bacteriostatic activity of the probiotic culture supernatant against different pathogen indicators

2.4 主要抑菌物质分析

对益生菌株可能产生的主要抑菌物质如有机酸、细菌素和过氧化氢进行分析，结果如图2 所示，将菌株培养上清液的pH 值调整为7.0 后，4 株益生菌的抑菌活性均显著降低（P＜ 0.01），说明4 株益生菌的主要抑菌物质都包括有机酸。而使用蛋白酶K处理益生菌培养液上清以排除其中的细菌素后，14和26 号菌株的抑菌活性极显著降低（P＜ 0.01），表明14、26 号菌株的主要抑菌物质包括细菌素。使用过氧化氢酶对益生菌株培养液上清进行处理后，12、26 和30 号菌株的抑菌活性出现极显著下降（P＜ 0.01），说明12、26、30 号菌株的主要抑菌物质包括过氧化氢。

图2 不同处理方式对益生菌培养液上清抑菌活性的影响Fig.2 Effect of different treatments on the antibacterial activity of the supernatant of the probiotic culture medium

2.5 生长特性

如图3 所示，在接种后的2 h 内，菌株生长处于延滞期；
2 ～12 h 处于对数期，增殖速度最快；
12 ～16 h 生长速度变慢；
16 h 之后基本到达平台期。4 株益生菌的生长状况良好，符合细菌生长特性。

图3 益生菌的生长曲线Fig.3 Growth curves of the probiotics

2.6 产酸能力

如图4 所示，随着培养时间的延长，4 株益生菌培养液的pH 值也随之降低，至培养24 h 后12、14、26、30 号菌株的pH 值分别降到4.52、4.69、4.69、4.60，并趋于稳定，表明4 株乳酸菌均具有较强的产酸性能。

图4 益生菌的产酸曲线Fig.4 The cid production curves of probiotics

2.7 益生菌对Caco-2 细胞的黏附能力

4 株益生菌的黏附能力如图5 所示，4 株菌的黏附能力差异较大，12 号菌株的黏附能力最为突出，黏附率达17.5%；
26 号菌株的黏附能力较好，黏附率达10.75%；
14 号和30 号菌株的黏附率分别为2.19%和4.38%。

图5 益生菌的黏附能力Fig.5 Adhesion capacity of probiotics

2.8 耐受性分析

2.8.1 耐胆盐 耐胆盐试验结果如图6 所示，在0.3%的胆盐浓度下将益生菌株处理6 h，4 株益生菌株都能存活，其中14 号菌株在胆盐溶液中的存活率最高，表明14 号菌株适应胆盐溶液的能力最强。

图6 益生菌在胆盐溶液中的存活率Fig.6 Survival rate of probiotics in bile salt solution

2.8.2 耐人工胃肠液 耐人工胃液试验结果如图7所示，在人工胃液和人工肠液中分别将益生菌株处理4 h，4 株益生菌株都能存活，其中26 号菌株在人工胃液中的存活率最高，表明26 号菌株适应人工胃液的能力最强；
14 号菌株在人工肠液中的存活率最高，表明14 号菌株适应人工肠液的能力最强。

图7 益生菌在人工胃液和人工肠液中的存活率Fig.7 Survival rate of probiotics in artificial gastric and artificial intestinal fluid

2.9 抗生素敏感性分析

如表3 所示，4 株益生菌对青霉素、氯霉素、四环素、氨苄西林等大多数抗生素敏感，对卡那霉素完全耐药，部分菌株对头孢曲松、红霉素、万古霉素、克林霉素、环丙沙星产生抗性。

表3 益生菌抗生素敏感性Table 3 Antibiotic susceptibility of probiotics

2.10 溶血性分析

试验结果如图8 所示，金黄色葡萄球菌在哥伦比亚血琼脂平板上出现明显β-溶血环（图A），4 株分离所得的益生菌株无溶血圈（图B-E），说明4 株益生菌均无溶血性。

图8 益生菌溶血性试验Fig.8 Probiotic-hemolytic test

选择益生菌作为畜牧养殖业中替代抗生素的物质以防治多种奶牛疾病已经成为研究热点，许多学者也已经证明益生菌具有预防和治疗多种病原菌导致疾病的作用［11-14］。有研究表明，牦牛源益生菌在体外可对大肠杆菌等5 种病原菌产生抑菌效果，并结合体内试验发现其还能减轻肠黏膜炎小鼠氧化应激反应和炎症反应并且可以改善小鼠盲肠肠道菌群紊乱［15］。本研究从2 ～14 日龄健康犊牛粪便中分离筛选出4 株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及临床分离株大肠杆菌K99 具有抑菌活性的益生菌株，经形态学观察和16S rDNA 测序分析，4 株益生菌为敏捷乳杆菌、戊糖片球菌、唾液乳杆菌和约氏乳杆菌，分别将其命名为12、14、26、30 号菌株。益生菌可以通过产生有机酸、细菌素和过氧化氢等物质以抑制病原菌的生长［16］。有机酸通过改变环境pH 值以抑制不耐酸病原菌的生长［17］。细菌素可以有效的抑制其他微生物的生长甚至杀死病原菌［18］。过氧化氢可能通过破坏病原菌膜基质的稳定性以及干扰病原菌与细胞的附着发挥其抑菌作用［19］。通过对4株益生菌的抑菌物质进行分析发现，12 和30 号菌株的抑菌物质为有机酸和过氧化氢，26 号菌株除有机酸和过氧化氢外还包括细菌素，14 号菌株的抑菌物质为有机酸和细菌素。孙艳等［20］对植物乳杆菌发酵液上清的抑菌活性和抑菌物质分析发现，5 株乳酸菌对大肠杆菌都具有抑菌活性且均可产生至少2 种抑菌物质，主要包括过氧化氢、细菌素和有机酸。与本试验结果相类似，益生菌通过产生一种或多种抑菌物质来抑制病原菌的生长繁殖。

本研究分离得到的4 株益生菌在培养16 h 后，菌株的生长趋于稳定，24 h 后培养液pH 值达4.5 左右，说明分离菌株的生长速度较快，同时还具有良好的产酸能力。菌种对胃肠道上皮细胞的黏附能力是益生菌能否在机体内定植进而发挥其益生作用的先决条件［21］，本研究使用形态和功能与成熟肠道上皮细胞相似的Caco-2 细胞建立体外模型，用于评价益生菌的黏附能力。根据黏附率进行比较评价，12号菌株是黏附性最强的菌株，26 号菌株的黏附率也在10%以上，对Caco-2 细胞株具有较强的黏附效果。此外，结果显示4 株益生菌株的黏附能力具有差异，这与其他研究结果一致，益生菌的黏附能力可能在很大程度上与菌株的自身性质紧密相关［22］。益生菌在体内发挥其益生作用还需要在胃肠道环境中定植生长。而胃肠道中不仅含有酸性物质和各种消化酶，还有由肝脏排入小肠内的胆汁，通常情况下，胃液呈酸性而肠液呈碱性［23］。因此，益生菌应对胆盐和胃肠液具有一定的耐受性。本研究中分离出的4 株益生菌对胆盐溶液以及人工胃肠液均具有良好的耐受性，其中，14 号菌株对胆盐溶液的耐受性最强，26 号菌株对人工胃液的耐受性最好，14 号菌株对人工肠液的耐受性最强。这与前人的研究结果一致［24-25］，表明候选益生菌株可以定植于胃肠道中并稳定生长繁殖，从而发挥其益生作用。

有研究发现，益生菌所携带的耐药基因可能会在肠道内其他微生物之间发生转移，从而导致肠道菌群的紊乱以及相关疾病的发生［26］。本研究通过纸片扩散法对分离得到4 株益生菌进行了抗生素敏感性试验，结果表明大多数菌株对青霉素、氯霉素、四环素、氨苄西林、头孢曲松、红霉素等多种常见抗生素敏感，但是4 株益生菌对卡那霉素完全耐药。有研究表明，乳酸菌可能对卡那霉素等氨基糖苷类药物存在天然耐药［27］，这也与向微微等［28］人的研究结果一致。这一结果为临床应用益生菌作为替抗物质提供了参考。在体外评价益生菌的安全性时，溶血试验是非常重要的指标之一。溶血是病原体中常见的致病因素，会导致宿主出现贫血、水肿症等，甚至会引起菌血症从而危及宿主生命［29］。本试验以金黄色葡萄球菌为阳性对照观察发现，4 株益生菌均不存在溶血现象。结合抗生素敏感性试验和溶血试验，初步认为4 株益生菌均为安全性菌株。

本试验从健康犊牛粪便中分离出了4株益生菌，具有良好的生长特性和产酸能力，并且对3 种病原指示菌具有较强的抗菌效果，同时对胃肠道环境具有良好的耐受性，对大部分常用抗生素敏感并且不具有溶血性，符合现阶段畜牧养殖业寻找安全高效、无残留污染的绿色替抗物质的迫切需求，为临床防治细菌性犊牛腹泻提供了理论依据，为进一步开发微生态制剂奠定了基础。

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