王浆酸对人结肠癌SW620,细胞增殖的抑制作用及其网络药理学分析

刘雅鑫, 刘 健, 李 祯, 曹占鸿, 白浩楠, 安 昱, 房星宇, 杨 擎, 李 辉, 李 娜

（1. 长春中医药大学 吉林省人参科学研究院中药分子药理实验室，吉林 长春 130117；
2. 吉林省前卫医院肛肠科，吉林 长春 130012）

结肠癌是人体消化系统最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症第二大常见死亡原因［1］。尽管结肠癌的治疗已经取得很大的进展，但其早期检出率仍相对较低，治疗手段以化疗为主［2］，尚无可靠的治疗方案。研究［3-4］显示：通过抑制细胞增殖、诱导氧化应激和阻断细胞周期，可以促进肿瘤细胞凋亡。蜂王浆是药食同源的保健食品， 王浆酸（10-hydroxydec-2-enoic acid，10-HDA） 作为蜂王浆的特有活性成分，其含量占蜂王浆脂肪酸50%以上［5］，具有预防和治疗消化道肿瘤的功效［6-9］，近年来受到广泛关注。有关10-HDA 对人结肠癌SW620 细胞的生长抑制作用目前国内外尚未见报道。网络药理学可依靠强大的数据搜索能力来解释疾病和药物的关系［10］。本研究采用网络药理学方法预测10-HDA 抗人结肠癌的生物学基础，以人结肠癌SW620 细胞作为研究对象，探讨10-HDA 对SW620 细胞增殖和迁移的抑制作用，阐明10-HDA抗结肠癌的作用机制，为研制10-HDA 预防和治疗结肠癌的新药提供理论依据。

1.1 细胞、药物、主要试剂和仪器人结肠癌SW620 细胞（美国培养物集存库， 批号：CBP60036）。10-HDA（上海源叶生物科技有限公司， 批号：
J31M9H62449）， 噻唑蓝（multiple table tournament，MTT） 和二甲基亚砜（北京金宏达生物科技有限公司，批号：0793 和J200016），聚偏二氟乙烯膜（英国MILLOPORE 公司，批号：CVWP2932A），总抗氧化能力（total antioxidant capacity， T-AOC） 和 超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD） 试剂盒（南京建成生物科技有限责任公司，批号：A001-3 和A-015-2-1）。

蛋白电泳仪（美国奥复公司， 型号：PS300B），转膜仪（美国Bio-Rad 公司，型号：04113R115669），凝胶成像仪（美国Aplegen 公司，型号：
CA94588-8552）， B 细 胞 淋 巴 瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋 白 水 解 酶 9 （cysteinyl aspartate specific proteinase-9， Caspase-9）、 细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、 糖原合成酶激酶 3β （glycogen synthase kinase 3 β， GSK3 β）、 β - 连环蛋白（β-catenin）和超敏ECL 化学发光检测试剂盒（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：50599-2-lg、26593-1-AP、 66470-2-lg、 10380-1-AP、 22104-1-AP、51067-2-AP、26939-1-AP 和P0018S）。

1.2 蜂王浆化学成分的筛选从中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TMSCP） （https：//old. tcmsp-e.com/tcmsp. php） 和 中 医 药 综 合 数 据 库（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID） （http：//www. megabionet. org/tcmid/）中检索获得蜂王浆活性成分。药代动力学特性包括药物吸收、 分布、 代谢和排泄（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME），其中ADME 是影响生物活性的关键因素。采用2 个ADME 相关参数，即口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和药物相似度（drug similarity，DL），筛选蜂王浆潜在的有效成分，根据TCMCP 数据库建议，口服给药后，OB 值≥30%被视为吸收良好，DL 值≥0.18 表明可用于药物开发。因此以OB≥30%和DL≥0.18，在小分子药物靶点在线平台Swiss Target Prediction 中数据库获取10-HDA 等小分子靶点，在蛋白质分析（Universal Protein，UniProt）数据库中进行标准基因名转换。

1.3 结肠癌相关靶点的收集在GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）和在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM） 数据库（https：//omim. org/） 中获得结肠癌靶点。以“Colon Cancer”为检索词，候选靶点重整合后作为蜂王浆防治结肠癌的潜在作用靶点。

1.4 蛋白-蛋白相作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建和拓扑分析靶点间PPI 网络通过String 数据库（https：//cn. string-db. org/） 获得，并使用Cytoscape 3.8.2 软件生成药物-疾病靶点网络。使用内置CytoNCA 分析插件，通过以下拓扑参数评估网络节点中心性特性：度中心性（degree centrality， DC）、 调节中心性 （betweenness centrality， BC） 和 接 近 中 心 性 （closeness centrality， CC）， 得到PPI 文件导入Cytoscape 3.8.2 软件绘制PPI 网络图。

1.5 基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析利用Metascape 数据库（https：//metascape. org/）对核心靶点进行富集分析，获取GO 和KEGG 富集通路，得到相应的生物过程（biological processes， BP）、 细胞组成 （cell composition，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG 信号通路，筛选条件P＜0.05。利用微生信网站（http：//www. bioinformatics.com. cn/） 绘制气泡图，对前10 位生物学过程信号通路进行可视化处理。

1.6 MTT 法检测不同剂量10-HDA 组SW620 细胞存活率取处于对数生长期内无污染的人结肠癌SW620 细胞，以5×104mL-1密度接种至96 孔细胞培养板中，加入不同剂量（1、 5、 10、 15 和20 mmol·L-1）10-HDA，药物组均设6 个平行，对照组给予培养液，培养24 h，每孔加入20 μL MTT （5 g·L-1），继续孵育4 h 后加入150 μL DMSO 终止反应。在波长490 nm 处检测各孔吸光度（A）值，计算各组细胞存活率。细胞存活率=给药组平均A 值/对照组平均A 值×100%。

1.7 Hoechst33342 染色法观察各组细胞形态表现将处于对数生长期内无污染的人结肠癌SW620 细胞分为对照组，低剂量（5 mmol·L-1）10-HDA 组、中剂量（10 mmol·L-1） 10-HDA 组和高剂量（15 mmol·L-1） 10-HDA 组， 以2×105mL-1密度接种于6 孔细胞培养板中，分别进行给药处理，培养箱孵育24 h 后，将培养液弃掉，PBS 缓冲液冲洗2次，每孔加入Hoechst33342染色液1 mL，染色30 min 后采用荧光显微镜观察各组细胞形态表现。

1.8 细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率将人结肠癌SW620 细胞以2×105mL-1密度接种至6 孔细胞培养板中，24 h 细胞贴壁后更换为低浓度（0.5%） 血清。当细胞密度达到90%汇合后，使用200 μL 移液管的尖端在6 孔细胞培养板中进行划痕，加入PBS 缓冲液除去划伤的细胞后加入DMEM 培养液。在实验开始及实验12、24 和48 h分别采用倒置显微镜观察拍照。采用Image J 软件统计划痕面积，计算细胞划痕愈合率。细胞划痕愈合率=（0 h 划痕面积-不同时间点划痕面积）/0 h 划痕面积×100%。

1.9 流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率取处于对数期的人结肠癌SW620 细胞，以2×105mL-1密度接种于6 孔细胞培养板中，按照“1.7”中的方法进行分组和给药处理，继续培养24 h。胰酶消化后，PBS 缓冲液冲洗2 次，再用70% 预冷乙醇重悬细胞， 4 ℃固定24 h，1 200 r·min-1离心5 min，添加PI 染色液500 μL 吹打混匀，在暗室内反应30 min，用200 目筛网过滤，在488 nm 波长处采用流式细胞术检测，采用ModFit 5.0 软件分析不同细胞周期细胞百分率。

1.10 生化法检测各组细胞中T-AOC 和SOD 活性细胞分组和给药处理按“1.7”步骤中的方法进行，按试剂盒说明要求进行操作，检测各组细胞中T-AOC和SOD活性（单位分别为mmol·g-1和U·mL-1）。

1.11 Western blotting 法检测各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、GSK3β、β-catenin 和CyclinD1 蛋白表达水平取处于对数期且状态良好的人结肠癌SW620 细胞，以2×105mL-1密度接种于6 孔细胞培养板中，按照“1.7”中的方法进行分组和给药处理后，胰酶消化，PBS 缓冲液洗涤3 次，将150 μL RIPA 蛋白裂解液加入细胞沉淀中置于1.5 mL EP 管内， 冰上裂解1 h， 4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min 吸取上清，蛋白定量后进行电泳、转膜和封闭，使用TBST 清洗3 次PVDF 膜后一抗4 ℃孵育过夜，二抗避光孵育2 h在凝胶成像仪中进行显色，采用Image J 软件分析目的蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin 蛋白条带灰度值。

1.12 统计学分析采用SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞存活率、细胞划痕愈合率和不同细胞周期细胞百分率，各组细胞中T-AOC 和SOD 活性，各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、GSK3β、β-catenin 和CyclinD1 蛋白表达水平，均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 蜂王浆活性成分和靶点预测在TCMSP 和TCMID 数据库中共获得6 种蜂王浆活性成分，得到363 个潜在靶点，其中非特异性成分中叶酸15 个靶点，花柄花黄素21 个靶点，木樨草素70 个靶点，山奈酚87 个靶点，橙皮素91 个靶点，10-HDA 33 个靶点。

2.2 结肠癌相关靶点从GeneCards 和OMIM 数据库中进行“Colon Cancer”的检索，剔除重复值，获得4 832 个靶点，获得活性成分靶点与疾病靶点135 个交集基因，绘制蜂王浆活性成分与结肠癌的相互关系图。见图1。

图1 蜂王浆活性成分-结肠癌交集靶点Fig. 1 Crossover targets of royal jelly active ingredientcolon cancer

2.3 药物-疾病网络和拓扑网络分析在网络中，化合物与靶点之间的交互作用愈强，则自由度（degree）值愈大。有6 种化合物作用靶点大于10，包括10-HDA、叶酸、花柄花黄素、木樨草素、山奈酚和橙皮素。将交集基因信息输入到Cytoscape 3.8.0 软件，筛选得到超过阈值靶点28 个，其中包括蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、 基 质 金 属 蛋 白 酶 9 （matrix metallopeptidase 9，MMP9）和过氧化物酶体增殖物激活受体G （peroxisome proliferator-activated receptor G，PPARG）等。见图2 和3。

图2 蜂王浆活性成分-结肠癌-靶点网络图Fig. 2 Network diagrams of rogal jelly active ingredientcolon cancer-target

图3 PPI 网络图Fig. 3 PPI network diagrams

2.4 核心靶点 GO 功能富集分析利用Metasacape 数据库对潜在的28 个靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析，结果显示：28 个靶点大部分富集在细胞生物组成和含蛋白复合物中，BP 显著富集对激素的调节、细胞对氮化合物的反应调节、细胞对生长因子刺激的调节、凋亡信号通路的调控和炎症反应的调节等。CC 显著富集在细胞周期依赖性蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物和线粒体基质等。MF 显著富集在激酶结合、蛋白激酶结合、核受体活性和一氧化氮合酶调节活性等。见图4。

2.5 核心靶点KEGG 信号通路富集分析KEGG富集分析结果显示：蜂王浆抗结肠癌的潜在作用机制显著富集在细胞周期、前列腺癌、细胞衰老和p53 信号通路等。因此选取显著性较高的细胞周期信号通路，而GSK3β/β-catenin 与细胞周期进程有密切关联，由此验证相关蛋白水平的表达，见图5。结合核心靶点以及对KEGG 信号通路的分析，最终选取活性成分10-HDA 作用于人结肠癌SW620细胞进行后续实验。

图5 KEGG 信号通路富集分析Fig. 5 KEGG signaling pathway enrichment analysis

2.6 各组细胞存活率培养24 h 后，与对照组比较，5、10、15 和20 mmol·L-110-HDA 组细胞存活率呈剂量依赖性降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 各组细胞存活率Tab. 1 Survival rates of cells in various groups(n=7， ， η/%）

表1 各组细胞存活率Tab. 1 Survival rates of cells in various groups(n=7， ， η/%）

*P＜0.05,**P＜0.01 compared with control group.

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2.7 各组细胞凋亡形态表现Hoechst33342 染色结果显示：与对照组比较，不同剂量10-HDA 组细胞中细胞核呈现明亮的蓝色凋亡特征的凋亡细胞数明显增多；
与低剂量10-HDA 组比较，中和高剂量10-HDA 组细胞中凋亡细胞数明显增多。见图6。

图6 各组细胞凋亡形态表现(Hoechst33342,×100)Fig. 6 Morphology of apoptosis of cells in various groups (Hoechst33342, ×100)

2.8 各组细胞划痕愈合率与对照组比较，各时间点不同剂量10-HDA 组细胞划痕愈合率明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），且随着10-HDA 剂量升高，细胞划痕愈合率逐渐降低。见图7 和表2。

表2 各组细胞划痕愈合率Tab. 2 Scratch healing rates of cells in various groups(n=3，，η/%）

表2 各组细胞划痕愈合率Tab. 2 Scratch healing rates of cells in various groups(n=3，，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

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图7 细胞划痕实验检测各组细胞迁移情况（Bar=200 μm）Fig. 7 Migration of cells in various groups detected by cell scratch test (Bar=200 μm)

2.9 各组不同细胞周期细胞百分率与对照组比较，低剂量10-HDA 组G0/G1期和S 期细胞百分率差异无统计学意义（P＞0.05）， 中和高剂量10-HDA 组G0/G1期细胞百分率明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），S 期细胞百分率明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），且呈剂量依赖性。见表3 和图8。

表3 各组不同细胞周期细胞百分率Tab. 3 Percentages of cells at different cell cycles in various groups(n=3，，η/%）

表3 各组不同细胞周期细胞百分率Tab. 3 Percentages of cells at different cell cycles in various groups(n=3，，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

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图8 各组不同细胞周期细胞百分率Fig. 8 Percentages of cells at different cell cycles in various groups

2.10 各组细胞中T-AOC 和SOD 活性与对照组比较，不同剂量10-HDA 组细胞中T-AOC 和SOD活性明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）；
与低剂量10-HDA 组比较，中和高剂量10-HDA 组T-AOC和SOD 活性明显降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组细胞中T-AOC 和SOD 活性Tab. 4 Activities of T-AOC and SOD in cells in various groups(n=6，）

表4 各组细胞中T-AOC 和SOD 活性Tab. 4 Activities of T-AOC and SOD in cells in various groups(n=6，）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group; △P＜0.05 compared with low dose of 10-HDA group.

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2.11 各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、GSK3β、β-catenin 和CyclinD1 蛋白表达水平与对照组比较，低剂量10-HDA 组细胞中Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），GSK3β 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；
与对照组比较，中和高剂量10-HDA 组细胞中Bax、Caspase-3、Caspase-9和GSK3β 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），Bcl-2、β-catenin 和CyclinD1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图9 和表5。

结肠癌是危害人类健康的第三大常见恶性肿瘤［11］。2023 年美国国家癌症统计数据［12］显示：2022 年美国约有15.2 万例结肠癌新发病例和5.2 万因结肠癌死亡病例。在发展中国家结肠癌发病率也逐年升高［13］。结肠癌的治疗手段除手术治疗外，还有化学疗法、免疫疗法和放射疗法等［14-15］，因抗肿瘤药物毒性和耐药性的影响［16-17］，开发新型抗结肠癌药物非常必要。蜂王浆具有滋补、益肝和健脾功效，10-HDA 是蜂王浆的重要质量评价指标，其在蜂王浆中的含量不少于1.4%［6］。随着对10-HDA 研究的深入，其抗肿瘤作用已成为研究热点。因此，本研究通过网络药理学方法探讨10-HDA 与结肠癌的内在联系，进而揭示10-HDA抗结肠癌的作用机制。

本研究通过TCMSP 等数据库，共检索得到10-HDA、叶酸和花柄花黄素等6 种蜂王浆有效活性成分；
通过筛选核心靶点和KEGG 信号通路富集分析得到核心特有成分10-HDA。本研究中，利用拓扑分析获得28 个核心靶点，其中AKT1 被认为是癌症发展过程中的主要参与者，参与细胞增殖和凋亡等生物过程［18］；
EGFR 在某些癌症中高表达，参与癌症的发展，包括细胞增殖和转移［19］，此外还有MMP9 等靶点；
表明10-HDA 可能通过靶向以上靶点影响结肠癌发展进程。研究［20］显示：肿瘤是一类细胞周期性疾病，细胞周期调控细胞生长全过程，在生命活动中起重要的作用，若细胞周期调控紊乱，细胞增殖异常，则诱发肿瘤。为了进一步研究10-HDA 的生物功能以及在信号通路中的作用，对10-HDA 的核心靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析，结果显示：10-HDA 的作用主要涉及细胞增殖和细胞生物合成等相关生物学过程，细胞周期信号通路与10-HDA作用于结肠癌关系最为密切。

本研究结果显示：与对照组比较，不同剂量10-HDA 组细胞存活率明显降低，细胞增殖能力下降，诱导SW620 细胞凋亡，且细胞划痕愈合率明显降低，表明10-HDA 可抑制SW620 细胞迁移能力，具有预防结肠癌转移扩散的作用。研究［21-22］表明：在癌症发展过程中阻断细胞周期可抑制细胞增殖。本研究中流式细胞术检测结果显示：与对照组比较，不同剂量10-HDA 组细胞中G0/G1期细胞百分率明显降低，S 期细胞百分率明显升高，表明10-HDA 具有抑制结肠癌细胞增殖的作用，使SW620 细胞发生S 期阻滞，进而诱导SW620 细胞凋亡。

氧化应激在慢性疾病中发挥重要作用［23］。研究［24-26］显示：为了维持细胞稳态，线粒体中多种抗氧化酶参与调节氧化还原平衡。SOD 是机体一种重要抗氧化酶，可清除自由基使细胞免遭攻击，对于肿瘤细胞可通过调节T-AOC 和SOD 活性来增加氧化应激。本研究结果显示：与对照组比较，不同剂量10-HDA 组细胞抗氧化活性降低，提示10-HDA 可以增强SW620 细胞氧化应激，加速细胞凋亡，从而达到预防和治疗结肠癌的作用。

线粒体是参与机体能量代谢和细胞凋亡过程的细胞器，受到不良刺激可导致细胞死亡［27-28］。研究［29-30］显示：在内源性线粒体途径中Bcl-2 蛋白家族中的Bcl-2 和Bax 对细胞凋亡起到重要调控作用，细胞色素C 释放到胞质中可激活Caspase-9，进而使Caspase-3 发生裂解导致细胞凋亡。本研究结果表明：10-HDA 可下调Bcl-2 蛋白表达水平及上调Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表达水平，通过调控线粒体依赖性凋亡途径促进SW620 细胞凋亡。

β-catenin 在癌症发展过程中起重要作用，研究［31-33］显示：GSK3β/β-catenin 信号通路参与细胞增殖过程，其作用机制与激活β-catenin 触发下游的靶基因进而促进癌细胞的增殖、转移和侵袭有关。CyclinD1 作为G1/S 期特异性周期蛋白，在肿瘤细胞中高度表达［34］。为了明确10-HDA 诱导细胞凋亡的机制，本研究进一步采用Western blotting 法检测GSK3β/β-catenin 信号通路相关蛋白表达水平，结果显示：与对照组比较，10-HDA 组细胞中GSK3β 蛋白表达水平明显升高，同时β-catenin 和CyclinD1 蛋白表达水平明显降低，提示10-HDA 抑制SW620 细胞增殖和促进其凋亡的作用可能与激活GSK3β/β-catenin 通路有关。

综上所述，本研究通过网络药理学方法联合体外实验深入研究了10-HDA 抗结肠癌的潜在机制，结果表明：10-HDA 可抑制SW620 细胞增殖和迁移，将细胞增殖阻滞在S 期，增强细胞氧化应激水平并加速细胞凋亡，其作用机制与激活GSK-3β/β-catenin 信号通路有关。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

刘雅鑫参与数据搜集、整理和分析及论文撰写，刘健、白浩楠、安昱和房星宇参与实验前期可行性分析和资料收集，李祯和曹占鸿参与后期数据处理和论文校对，杨擎参与论文撰写指导，李辉参与论文审校和相关疾病临床方向的指导，李娜参与论文最终审校和论文修改。

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