牡荆素调控PERK-CHOP内质网应激途径对帕金森病模型小鼠神经功能的改善作用研究*

朱宝平,于丹丹,曾聪慧,赵 波,刘 俊

喀什地区第一人民医院药学部,新疆喀什 844099

帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病,其主要病理特征为黑质多巴胺神经元的渐进性丧失以及路易体和路易神经突的形成,对患者的身心健康和生活质量造成了极大的威胁[1-2]。PD发病机制复杂,内质网应激被认为是其中的一个重要因素,因此,针对内质网应激的干预对PD治疗有着重要意义[3]。蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-C/EBP同源蛋白(CHOP)途径与内质网应激联系密切[4],有研究指出[5],姜黄素可通过抑制PERK/CHOP内质网应激通路降低2型糖尿病大鼠的血糖,提高脂联素水平。牡荆素是从牡荆叶和牡荆子中提取出的天然黄酮类化合物,除了抗癌、抗氧化、抗病毒作用,还具有包括抗记忆损伤、抗老年痴呆、抗抑郁、抗癫痫、镇痛等神经系统保护作用[6-7],已有研究证实,牡荆素可以保护多巴胺能神经元[8],但牡荆素能否通过调节PERK-CHOP内质网应激途径来改善PD小鼠神经功能尚不清楚,故本实验旨在探讨牡荆素调节PERK-CHOP内质网应激途径对PD小鼠神经功能的影响。

1.1实验动物 成年雄性C57BL/6J小鼠(购自新疆医科大学动物实验中心),SPF级,体重28～30 g,8～10周龄,生产许可证号为SCXK(新)2021-008。于维持屏障环境的动物房中饲养小鼠:光照明暗各12 h、湿度55%～65%、温度20～23 ℃,适应饲养7 d。

1.2仪器与试剂 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP,纯度为99%,货号:M0896)购自美国Sigma公司;左旋多巴(国药准字:H33021919)购自福安药物集团宁波天衡制药有限公司;CCT020312(规格:5 mg)购自深圳海思安生物技术有限公司;牡荆素(纯度:HPLC≥98%)、通用SP免疫组织化学试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、小鼠白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、小鼠IL-1β 试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司;兔源抗小鼠Bcl-2相关X蛋白(Bax)一抗、兔源抗小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗、兔源抗小鼠半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗购于上海碧云天生物技术有限公司;兔源抗小鼠CHOP一抗、兔源抗小鼠PERK一抗、兔源抗小鼠酪氨酸羟化酶(TH)一抗购于美国Abcam公司;XR-YLS-4C型转棒式疲劳仪购自上海欣软信息科技有限公司;FlexA-200型全波长酶标仪购自山东莱索科技有限公司;ML41型双目倒置生物显微镜购自广州市明美光电技术有限公司等。

1.3PD小鼠模型的构建及分组给药 参照文献[9]采用腹腔注射MPTP的方法构建PD小鼠模型:腹腔注射MPTP 30 mg/kg/d,连续注射5 d,当注射完成后,观察小鼠的行为学变化,以小鼠出现呼吸急促、震颤、竖毛、步态不稳等反应表示建模成功。将造模成功的60只PD小鼠分为高剂量牡荆素组、低剂量牡荆素组、模型组、激活剂组、阳性对照组,每组12只,另选12只正常的C57BL/6J小鼠作为对照组。用生理盐水溶解牡荆素、阳性药左旋多巴和PERK激活剂CCT020312,高剂量牡荆素组、低剂量牡荆素组、阳性对照组小鼠分别按照50 mg/kg、25 mg/kg的牡荆素和20 mg/kg的左旋多巴进行灌胃,激活剂组小鼠按照50 mg/kg的牡荆素灌胃后还需灌胃2 mg/kg的CCT020312,对照组及模型组小鼠每天灌胃等体积的生理盐水1次,时间持续4周。

1.4检测小鼠运动功能 转棒实验:将各组小鼠放在转棒仪上,给予30 s的时间适应,启动转棒仪,转速在30 s内达到26 r/min,记录小鼠第1次从棒上跌落的时间;爬杆实验:取长50 cm,粗1 cm铁杆作为爬杆,缠上医用胶带防止打滑,各组小鼠在实验前1周每天依次训练,于最后依次治疗后将小鼠放在爬杆上端,以小鼠双前上肢接触杆底平台为爬完全程,记录所需时间。

1.5HE染色检测脑部黑质区多巴胺能神经元形态变化 每组选取6只小鼠,麻醉处死小鼠后迅速断头,冰上取脑,分离出黑质区和海马区,采用4%多聚甲醛固定24 h,石蜡包埋后分别切成6 μm厚的切片,将脑部黑质区切片用伊红或苏木精染色后进行组织病理学观察。

1.6免疫组化法检测小鼠脑组织黑质区TH表达 取脑部黑质区切片,脱蜡,水化后进行抗原修复,内源性过氧化物酶反应,滴加一抗TH孵育过夜,滴加二抗,DAB显色,苏木素复染,在显微镜下观察并利用Image J软件分析统计阳性细胞数。

1.7TUNEL染色检测小鼠海马区神经元凋亡 取1.5中脑部海马区切片进行染色(TUNEL细胞凋亡检测试剂盒)。其中,总细胞核用DAPI染色,凋亡细胞核为绿色荧光染色。在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况,海马区神经元凋亡率等于TUNEL阳性细胞/DAPI染色细胞核×100%。

1.8ELISA检测试剂盒检测小鼠脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平 每组另外选取6只小鼠,按照1.5的方法处死小鼠并收集脑组织,匀浆、裂解、收集上清液,按照TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒说明书检测小鼠脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.9Western blot检测蛋白表达 取1.8中的脑组织匀浆,提取总蛋白(采用RIPA裂解缓冲液),将蛋白质进行定量、电泳、转膜、封闭,然后将膜与一抗PERK、CHOP、Bax、caspase-3、GAPDH按照对应比例孵育过夜(4 ℃下),然后将膜暴露于HRP标记的二抗中1 h。ECL试剂检测蛋白质印迹,Image LabTM软件分析目标蛋白的灰度值。

2.1各组小鼠运动功能比较 与对照组比较,模型组小鼠的下落潜伏期明显减少,爬杆时间明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量牡荆素组和阳性对照组小鼠的下落潜伏期明显增加,爬杆时间明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);与高剂量牡荆素组比较,激活剂组小鼠的下落潜伏期显著减少,爬杆时间显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠运动功能比较

2.2各组小鼠脑部黑质区病理形态比较 与对照组比较,模型组小鼠脑内黑质区神经元数量明显减少,核仁染色明显,胞浆染色变深,且可见较多空泡化变性神经元;与模型组比较,低、高剂量牡荆素组和阳性对照组小鼠的神经元数目增多,空泡化变性减少;与高剂量牡荆素组比较,激活剂组小鼠的核仁和胞浆染色加深,见图1。

图1 HE染色检测各组小鼠脑部黑质区病理形态变化(×400)

2.3各组小鼠脑组织黑质区TH阳性细胞数目比较 与对照组比较,低剂量牡荆素组、激活剂组、模型组小鼠TH阳性细胞数目显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量牡荆素组和阳性对照组小鼠TH阳性细胞数目明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与高剂量牡荆素组比较,激活剂组小鼠TH阳性细胞数目减少,差异有统计学意义(P<0.05),见图2和表2。

图2 免疫组化法检测各组小鼠神经细胞中TH表达(×100)

表2 各组小鼠神经细胞TH阳性细胞数目比较

2.4各组小鼠海马区神经元凋亡比较 小鼠海马区神经元凋亡率其他各组比对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);低、高剂量牡荆素组和阳性对照组小鼠海马区神经元凋亡率比模型组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与高剂量牡荆素组比较,激活剂组小鼠海马区神经元凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05),见表3和图3。

图3 TUNEL染色检测小鼠海马区神经元凋亡(×200)

表3 各组小鼠海马区神经元凋亡率比较

2.5各组小鼠脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较 模型组、低剂量牡荆素组、激活剂组小鼠脑组织中IL-6、TNF-α、IL-1β水平比对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);低、高剂量牡荆素组和阳性对照组小鼠脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比模型组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与高剂量牡荆素组比较,激活剂组小鼠脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平上升,差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

表4 各组小鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

2.6各组小鼠脑组织中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平比较 与对照组相比较,模型组小鼠脑组织中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量牡荆素组和阳性对照组小鼠脑组织中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与高剂量牡荆素组比较,激活剂组小鼠脑组织中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图4、表5。

注:A为对照组;B为模型组;C为低剂量牡荆素组;D为高剂量牡荆素组;E为阳性对照组;F为激活剂组。

表5 各组小鼠脑组织中Bax、caspase-3、PERK、CHOP蛋白水平比较

PD是由多种因素介导的慢性神经退行性疾病,随着我国人口老龄化的加剧,其发病率升高,给我国的医疗系统带来沉重的压力[10-12]。目前主要依赖左旋多巴、多巴胺受体激动剂等药物缓解PD患者症状,但中晚期患者存在疗效差,有不良反应等问题[13-15]。因此,开发新的治疗药物对PD患者有重大意义。本文通过向C57BL/6J小鼠腹腔注射MPTP的方法构建PD模型,结果发现,造模小鼠脑组织炎症细胞因子水平升高,引发炎症,造成黑质区多巴胺能神经元缺失和海马区神经元凋亡,并导致小鼠转棒实验下落潜伏期降低,爬杆实验时间增加,表明造模小鼠出现运动障碍,揭示PD模型构建成功。

有研究显示,内质网应激和神经炎症是造成PD动物模型多巴胺能神经元丢失和神经细胞凋亡的主要病理因素,抑制内质网应激和神经炎症发生发展可有效改善PD症状[16-17]。牡荆素又称牡荆苷,是一种具有显著抗炎、抑制应激作用和保护神经的天然化合物,可显著缓解丙烯酰胺神经毒素诱导的斑马鱼幼虫的组织学和行为学变化[18-19],还可以改善异氟醚诱导的神经元凋亡和记忆障碍[20],因此推测牡荆素可能具有抗PD作用。本文以不同剂量牡荆素处理PD小鼠,可降低小鼠爬杆时间、海马区神经元凋亡率、TNF-α、IL-6及IL-1β水平,提高下落潜伏期、黑质区多巴胺能神经元数量,表明牡荆素可抑制炎症细胞因子表达,减少黑质区多巴胺能神经元损伤和海马区神经元凋亡,修复PD小鼠运动功能,明显改善其神经功能。

PERK-CHOP作为内质网应激主要的调控信号,在神经保护方面具有重要作用[21-22]。白藜芦醇可通过调控PERK-ATF4-CHOP信号通路抑制内质网应激,发挥脑神经细胞保护作用[23]。有研究表明,GSK2606414可抑制PERK/p-eIF2α/ATF4/CHOP轴并增强线粒体功能,减轻高糖诱导的神经母细胞瘤神经毒性[24]。还有研究表示,黄芪甲苷-Ⅳ可通过减少CHOP蛋白水平从而抑制神经元凋亡[25]。因此推测抑制PERK-CHOP内质网应激途径可能是牡荆素改善神经功能的作用机制,本文结果显示,牡荆素可降低PD小鼠脑组织PERK及CHOP蛋白水平,表明牡荆素可通过调控PERK/CHOP信号改善PD小鼠神经功能,以牡荆素和PERK激活剂CCT020312同时处理PD小鼠,相比牡荆素单独处理,可促使小鼠爬杆时间、海马区神经元凋亡率、TNF-α、IL-6及IL-1β水平、脑组织PERK、CHOP、Bax、caspase-3蛋白水平升高,下落潜伏期、黑质区多巴胺能神经元数量降低,表明CCT020312可减弱牡荆素对PERK-CHOP内质网应激途径及炎症的抑制,且对于牡荆素对海马区神经元凋亡的缓解和黑质区多巴胺能神经元损伤起着拮抗作用,最终逆转牡荆素对PD小鼠神经、运动功能的改善作用,揭示牡荆素是通过抑制PERK-CHOP内质网应激途径从而改善PD模型小鼠神经功能。

综上所述,牡荆素可改善PD小鼠运动功能障碍,减轻炎症反应,发挥神经保护作用,这可能是通过抑制PERK-CHOP内质网应激途径实现。

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