泰山磐石散对自然流产模型大鼠子宫蜕膜组织中T-bet/GATA-3的影响

陆登艳，陈苏苏，钟 滨，陈 越，钟玉环，王 林，黄玉梅，江 澍

（福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122）

自然流产（spontaneous abortion，SA），中医学属“胎漏”“滑胎”“胎动不安”［1］。据统计SA 发病风险占临床妊娠的10%～15%［2］。其病因十分复杂，包括免疫调节失衡、内分泌异常、子宫解剖结构异常等［3］。有研究表明，免疫调节失衡是SA 的重要病理机制之一［4］。T 盒子转录因子（T-bet）和GATA 结合蛋白3（GATA-3）是重要的免疫调节因子，它们对免疫细胞的分化和功能具有重要作用［5］。泰山磐石散是治疗SA 的经典方剂，也是我国古代安胎方剂中的代表之一，出自《古今医统大全》，由人参一钱（3 g）、黄芪一钱（3 g）、白术五分（1.5 g）、炙甘草五分（1.5 g）、当归一钱（3 g）、川芎八分（2 g）、白芍药八分（2 g）、熟地黄八分（2 g）、川续断一钱（3 g）、糯米一撮（3 g）、黄芩一钱（3 g）、砂仁五分（1.5 g）组成［6］。前期研究表明，泰山磐石散可以明显降低大鼠血清中Th1 经典分泌因子干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）的表达；
明显升高Th2 型经典分泌因子白细胞介素-10（IL-10）的表达，从而改善胚胎流产情况［7］。因此，本研究通过观察泰山磐石散对自然流产模型大鼠蜕膜组织中Th1/Th2 型细胞特异性转录因子T-bet/GATA-3 表达水平的影响，以期为SA 的防治提供可靠的实验依据。

1.1实验动物 SPF级屏障系统中的SD大鼠30只，雌雄各半，体质量240±20 g，均来自上海斯莱克实验动物公司，实验动物许可证号为：SCXK（沪）2018-0004，于福建中医药大学实验动物中心中统一喂养，其室内温度为（25±1）℃，空气湿度为（50±10）%，每12 h 明暗循环交换，大鼠可自由摄食和饮水。动物使用许可证编号为SYXK（闽）2020-0002，本研究已获福建中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（审批号：FJTCM IACUC 2022171）。

1.2实验药物 溴隐亭（规格：2.5 mg/片，瑞士诺华制药有限公司，生产批号：T2B350A）。泰山磐石散组方：人参3 g，黄芪3 g，白术1.5 g，炙甘草1.5 g，当归3 g，川芎2 g，白芍药2 g，熟地黄2 g，川续断3 g，糯米3 g，黄芩3 g，砂仁1.5 g（后下）。中药材由福建中医药大学附属第三人民医院中药房提供。

1.3试剂与仪器 GATA-3 抗体（批号：sc-268）、T-bet 抗体（批号：sc-21749）均购自美国Sant Cruz公司；
二抗（批号：SA00001-1）购自武汉三鹰生物技术有限公司；
Western 专用一抗二抗稀释液（批号：AR1017）购自中国武汉博士德生物工程有限公司；
浓缩型SABCCY3（POD）（小鼠IgG）免疫组化试剂盒（批号：SA1041）购自中国武汉博士德生物工程有限公司；
电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；
电泳槽（美国Bio-Rad 公司）；
包埋机（德国MICROM 公司）；
半自动石蜡切片机（德国MICROM 公司）；
倒置显微镜（日本Nikon 公司）。

2.1药液制备 泰山磐石散中除砂仁外，先用1 000 mL 的蒸馏水提前浸泡30 min 后再用大火煮沸，再改用小火煮25 min，最后加入提前捣碎的砂仁煮5 min。所得药液用干净的双层纱布过滤；
再用500 mL 蒸馏水将未滤过的药渣大火煮沸，改小火煮30 min 后经纱布过滤；
将2 次所得药液水浴蒸发至28.5 mL，使得终浓度为1 g/mL。

2.2分组、造模及给药 SD 大鼠适应性喂养1 周后，提前将雌雄SD 大鼠按照1∶1 比例合笼，次日早上8 点观察雌性大鼠有无脱落的阴栓。发现阴栓者则记录为妊娠第1 天，同时记录妊娠大鼠体质量。将妊娠雌鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组和治疗组。空白组于妊娠的第1～11 天灌服生理盐水，第6～8 天皮下注射生理盐水；
模型组于妊娠的第1～11 天灌服生理盐水，第6～8 天皮下注射0.4 mg/（kg·d）溴隐亭溶液建立SA 模型；
治疗组于妊娠的第1～11 天灌服10 g/（kg·d）泰山磐石散药液，第6～8 天皮下注射0.4 mg/（kg·d）溴隐亭溶液。

2.3取材 于实验结束次日使用1 g/kg 乌拉坦腹腔麻醉，待大鼠完全麻醉后进行解剖，观察并记录胚胎发育情况，快速分离孕鼠的子宫蜕膜组织，然后将其置于提前预冷的PBS 溶液中清洗，将用于后续石蜡包埋实验的子宫蜕膜组织放入4%多聚甲醛中固定24 h，后期用于HE 染色和免疫组化实验。

2.4观察指标

2.4.1妊娠大鼠生命状态及体质量增长变化 观察3 组妊娠大鼠运动状态、毛发色泽及饮食等一般状况。

体质量增长值（g）＝妊娠第11 天体质量－妊娠第1 天体质量

2.4.2妊娠大鼠胚胎发育及吸收情况 观察妊娠大鼠胚胎大小、颜色等一般发育状况。

胚胎吸收率/%＝（胚胎吸收数÷胚胎总数）×100%

2.4.3大鼠子宫蜕膜组织的病理变化 将蜕膜组织用4%多聚甲醛固定后切片（5 μM），进行脱蜡水化后用苏木素染色反蓝，再用伊红染色并脱水，封片后可在显微镜下固定同一视野观察3 组大鼠子宫蜕膜组织中细胞分布排列、血管发育等形态学的改变情况。

2.4.4免疫组化法检测大鼠子宫蜕膜组织中转录因子T-bet 和GATA-3 蛋白表达水平 严格按照购买的试剂盒说明书进行操作。主要分为3 个模块：第一是固定、脱水；
第二进行包埋、切片、制片；
第三是染色。最后在显微镜下拍照。使用Image-Pro-Plus 6.0 分析图像的平均光密度（IOD/Area）。

2.4.5Western blot 测定大鼠子宫蜕膜组织转录因子T-bet 和GATA-3 蛋白表达量 先提取并制备子宫蜕膜组织蛋白样本；
然后进行电泳；
最后转膜与显色。使用Image Lab 进行灰度值分析。

2.5统计学方法 采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3.13 组大鼠一般状态及体质量增长情况 空白组大鼠背毛干净有光泽，活泼好动，饮食正常；
模型组大鼠运动少，背毛粗糙无光泽，摄入食物较少；
治疗组大鼠相对活跃，体毛顺滑有光泽，饮食适量。3 组大鼠体质量增长情况见表1。

表1 3 组大鼠妊娠第1～11 天体质量增长情况比较（±s）

表1 3 组大鼠妊娠第1～11 天体质量增长情况比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；
与模型组比较，2） P＜0.05。

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3.23 组胚胎吸收及发育情况 空白组大鼠胚胎发育良好大小均一、饱满、颜色粉红明亮，无胚胎吸收；
模型组的胚胎呈深紫色严重淤血，且胚胎大小不等，长势不均，胚胎发育异常；
治疗组接近对照组胚胎发育情况。与空白组比较，模型组大鼠胚胎吸收率明显升高（P＜0.05）；
与模型组比较，治疗组大鼠胚胎吸收率明显降低（P＜0.05）。见图1和表2。

图1 3 组胚胎发育情况

表2 3 组胚胎吸收情况比较

3.33 组子宫蜕膜组织的病理变化 空白组大鼠子宫蜕膜组织中细胞分布均匀，排列整齐，细胞核呈蓝紫色的圆形或椭圆形，血管丰富；
模型组的子宫蜕膜组织中细胞排列紊乱、分布不均，血管扩张严重；
治疗组子宫蜕膜组织形态接近对照组。见图2。

图2 3 组蜕膜组织病理情况（HE 染色，×200）

3.43 组子宫蜕膜组织T-bet 和GATA-3 蛋白表达水平 见图3 和表3。

图3 3 组子宫蜕膜组织T-bet 和GATA-3 蛋白表达情况（免疫组化，×400）

表3 3 组蜕膜组织中T-bet 和GATA-3蛋白表达水平比较（±s）

表3 3 组蜕膜组织中T-bet 和GATA-3蛋白表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；
与模型组比较，2） P＜0.05。

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3.53 组子宫蜕膜组织中T-bet 和GATA-3 蛋白表达量 见图4、表4。

图4 3 组蜕膜组织蛋白条带图

表4 3 组蜕膜组织T-bet 和GATA-3蛋白表达量比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；
与模型组比较，2） P＜0.05。

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自然流产是一种常见的妊娠并发症［3］。越来越多的研究表明，免疫因素的调控作用在自然流产中发挥着重要的作用，其参与了胚胎着床、细胞凋亡、炎症反应等多个方面的生物学过程，因此免疫平衡在维持胎儿生存和发育中发挥着重要的作用［8］。研究表明在自然流产的发生和发展中，Th1/Th2 免疫失衡可能是导致胚胎死亡和流产的重要因素之一。因此，Th1/Th2 免疫平衡可能是预防和治疗流产的新靶点［9］。

研究表明，通过纠正Th1/Th2 免疫因子失衡，自然流产患者的妊娠结局能得到明显改善［10］。Tbet 作为Th1 型免疫细胞的特异性转录因子，不仅能够促进Th1 型细胞分化；
还能诱导Th1 型经典细胞因子IFN-γ 的分泌［11］。Th2 型免疫细胞的特异性转录因子GATA-3，促进Th2 型免疫细胞发育的同时，还可以诱导Th2 型经典细胞因子IL-4 的分泌，同时还能一定程度地抑制Th1 型细胞的免疫反应［5］。

泰山磐石散是一种具有调节免疫功能的中药复方，已被证明具有调节免疫功能的作用［12-13］。本研究结果显示，泰山磐石散可下调自然流产模型大鼠蜕膜组织中T-bet 的蛋白表达水平，同时上调GATA-3 蛋白表达水平。而且经泰山磐石散治疗后大鼠蜕膜组织的免疫病理损伤明显改善。这可能因为Th2 型免疫应答占优势，而Th1 型免疫应答减弱。前期研究发现，泰山磐石散可下调自然流产模型大鼠血清中IFN-γ 的表达水平，而血清中IL-4的表达水平则明显上升［6］。综上，泰山磐石散可能是通过影响T-bet/GATA-3 信号通路，下调妊娠大鼠子宫蜕膜组织中T-bet 的蛋白表达水平，同时上调GATA-3 蛋白表达水平，从而抑制Th1 型免疫反应促进Th2 型免疫反应，从而调控Th1/Th2 免疫平衡以改善大鼠妊娠结局。

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