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泰山磐石散对自然流产模型大鼠子宫蜕膜组织中T-bet/GATA-3的影响

来源:专题范文 时间:2024-10-16 13:57:02

陆登艳,陈苏苏,钟 滨,陈 越,钟玉环,王 林,黄玉梅,江 澍

(福建中医药大学中西医结合学院,福建 福州 350122)

自然流产(spontaneous abortion,SA),中医学属“胎漏”“滑胎”“胎动不安”[1]。据统计SA 发病风险占临床妊娠的10%~15%[2]。其病因十分复杂,包括免疫调节失衡、内分泌异常、子宫解剖结构异常等[3]。有研究表明,免疫调节失衡是SA 的重要病理机制之一[4]。T 盒子转录因子(T-bet)和GATA 结合蛋白3(GATA-3)是重要的免疫调节因子,它们对免疫细胞的分化和功能具有重要作用[5]。泰山磐石散是治疗SA 的经典方剂,也是我国古代安胎方剂中的代表之一,出自《古今医统大全》,由人参一钱(3 g)、黄芪一钱(3 g)、白术五分(1.5 g)、炙甘草五分(1.5 g)、当归一钱(3 g)、川芎八分(2 g)、白芍药八分(2 g)、熟地黄八分(2 g)、川续断一钱(3 g)、糯米一撮(3 g)、黄芩一钱(3 g)、砂仁五分(1.5 g)组成[6]。前期研究表明,泰山磐石散可以明显降低大鼠血清中Th1 经典分泌因子干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-2(IL-2)的表达;
明显升高Th2 型经典分泌因子白细胞介素-10(IL-10)的表达,从而改善胚胎流产情况[7]。因此,本研究通过观察泰山磐石散对自然流产模型大鼠蜕膜组织中Th1/Th2 型细胞特异性转录因子T-bet/GATA-3 表达水平的影响,以期为SA 的防治提供可靠的实验依据。

1.1实验动物 SPF级屏障系统中的SD大鼠30只,雌雄各半,体质量240±20 g,均来自上海斯莱克实验动物公司,实验动物许可证号为:SCXK(沪)2018-0004,于福建中医药大学实验动物中心中统一喂养,其室内温度为(25±1)℃,空气湿度为(50±10)%,每12 h 明暗循环交换,大鼠可自由摄食和饮水。动物使用许可证编号为SYXK(闽)2020-0002,本研究已获福建中医药大学实验动物伦理委员会审批通过(审批号:FJTCM IACUC 2022171)。

1.2实验药物 溴隐亭(规格:2.5 mg/片,瑞士诺华制药有限公司,生产批号:T2B350A)。泰山磐石散组方:人参3 g,黄芪3 g,白术1.5 g,炙甘草1.5 g,当归3 g,川芎2 g,白芍药2 g,熟地黄2 g,川续断3 g,糯米3 g,黄芩3 g,砂仁1.5 g(后下)。中药材由福建中医药大学附属第三人民医院中药房提供。

1.3试剂与仪器 GATA-3 抗体(批号:sc-268)、T-bet 抗体(批号:sc-21749)均购自美国Sant Cruz公司;
二抗(批号:SA00001-1)购自武汉三鹰生物技术有限公司;
Western 专用一抗二抗稀释液(批号:AR1017)购自中国武汉博士德生物工程有限公司;
浓缩型SABCCY3(POD)(小鼠IgG)免疫组化试剂盒(批号:SA1041)购自中国武汉博士德生物工程有限公司;
电泳仪(美国Bio-Rad 公司);
电泳槽(美国Bio-Rad 公司);
包埋机(德国MICROM 公司);
半自动石蜡切片机(德国MICROM 公司);
倒置显微镜(日本Nikon 公司)。

2.1药液制备 泰山磐石散中除砂仁外,先用1 000 mL 的蒸馏水提前浸泡30 min 后再用大火煮沸,再改用小火煮25 min,最后加入提前捣碎的砂仁煮5 min。所得药液用干净的双层纱布过滤;
再用500 mL 蒸馏水将未滤过的药渣大火煮沸,改小火煮30 min 后经纱布过滤;
将2 次所得药液水浴蒸发至28.5 mL,使得终浓度为1 g/mL。

2.2分组、造模及给药 SD 大鼠适应性喂养1 周后,提前将雌雄SD 大鼠按照1∶1 比例合笼,次日早上8 点观察雌性大鼠有无脱落的阴栓。发现阴栓者则记录为妊娠第1 天,同时记录妊娠大鼠体质量。将妊娠雌鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组和治疗组。空白组于妊娠的第1~11 天灌服生理盐水,第6~8 天皮下注射生理盐水;
模型组于妊娠的第1~11 天灌服生理盐水,第6~8 天皮下注射0.4 mg/(kg·d)溴隐亭溶液建立SA 模型;
治疗组于妊娠的第1~11 天灌服10 g/(kg·d)泰山磐石散药液,第6~8 天皮下注射0.4 mg/(kg·d)溴隐亭溶液。

2.3取材 于实验结束次日使用1 g/kg 乌拉坦腹腔麻醉,待大鼠完全麻醉后进行解剖,观察并记录胚胎发育情况,快速分离孕鼠的子宫蜕膜组织,然后将其置于提前预冷的PBS 溶液中清洗,将用于后续石蜡包埋实验的子宫蜕膜组织放入4%多聚甲醛中固定24 h,后期用于HE 染色和免疫组化实验。

2.4观察指标

2.4.1妊娠大鼠生命状态及体质量增长变化 观察3 组妊娠大鼠运动状态、毛发色泽及饮食等一般状况。

体质量增长值(g)=妊娠第11 天体质量-妊娠第1 天体质量

2.4.2妊娠大鼠胚胎发育及吸收情况 观察妊娠大鼠胚胎大小、颜色等一般发育状况。

胚胎吸收率/%=(胚胎吸收数÷胚胎总数)×100%

2.4.3大鼠子宫蜕膜组织的病理变化 将蜕膜组织用4%多聚甲醛固定后切片(5 μM),进行脱蜡水化后用苏木素染色反蓝,再用伊红染色并脱水,封片后可在显微镜下固定同一视野观察3 组大鼠子宫蜕膜组织中细胞分布排列、血管发育等形态学的改变情况。

2.4.4免疫组化法检测大鼠子宫蜕膜组织中转录因子T-bet 和GATA-3 蛋白表达水平 严格按照购买的试剂盒说明书进行操作。主要分为3 个模块:第一是固定、脱水;
第二进行包埋、切片、制片;
第三是染色。最后在显微镜下拍照。使用Image-Pro-Plus 6.0 分析图像的平均光密度(IOD/Area)。

2.4.5Western blot 测定大鼠子宫蜕膜组织转录因子T-bet 和GATA-3 蛋白表达量 先提取并制备子宫蜕膜组织蛋白样本;
然后进行电泳;
最后转膜与显色。使用Image Lab 进行灰度值分析。

2.5统计学方法 采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,各组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3.13 组大鼠一般状态及体质量增长情况 空白组大鼠背毛干净有光泽,活泼好动,饮食正常;
模型组大鼠运动少,背毛粗糙无光泽,摄入食物较少;
治疗组大鼠相对活跃,体毛顺滑有光泽,饮食适量。3 组大鼠体质量增长情况见表1。

表1 3 组大鼠妊娠第1~11 天体质量增长情况比较(±s)

表1 3 组大鼠妊娠第1~11 天体质量增长情况比较(±s)

注:与空白组比较,1) P<0.05;
与模型组比较,2) P<0.05。

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3.23 组胚胎吸收及发育情况 空白组大鼠胚胎发育良好大小均一、饱满、颜色粉红明亮,无胚胎吸收;
模型组的胚胎呈深紫色严重淤血,且胚胎大小不等,长势不均,胚胎发育异常;
治疗组接近对照组胚胎发育情况。与空白组比较,模型组大鼠胚胎吸收率明显升高(P<0.05);
与模型组比较,治疗组大鼠胚胎吸收率明显降低(P<0.05)。见图1和表2。

图1 3 组胚胎发育情况

表2 3 组胚胎吸收情况比较

3.33 组子宫蜕膜组织的病理变化 空白组大鼠子宫蜕膜组织中细胞分布均匀,排列整齐,细胞核呈蓝紫色的圆形或椭圆形,血管丰富;
模型组的子宫蜕膜组织中细胞排列紊乱、分布不均,血管扩张严重;
治疗组子宫蜕膜组织形态接近对照组。见图2。

图2 3 组蜕膜组织病理情况(HE 染色,×200)

3.43 组子宫蜕膜组织T-bet 和GATA-3 蛋白表达水平 见图3 和表3。

图3 3 组子宫蜕膜组织T-bet 和GATA-3 蛋白表达情况(免疫组化,×400)

表3 3 组蜕膜组织中T-bet 和GATA-3蛋白表达水平比较(±s)

表3 3 组蜕膜组织中T-bet 和GATA-3蛋白表达水平比较(±s)

注:与空白组比较,1) P<0.05;
与模型组比较,2) P<0.05。

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3.53 组子宫蜕膜组织中T-bet 和GATA-3 蛋白表达量 见图4、表4。

图4 3 组蜕膜组织蛋白条带图

表4 3 组蜕膜组织T-bet 和GATA-3蛋白表达量比较(±s)

注:与空白组比较,1) P<0.05;
与模型组比较,2) P<0.05。

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自然流产是一种常见的妊娠并发症[3]。越来越多的研究表明,免疫因素的调控作用在自然流产中发挥着重要的作用,其参与了胚胎着床、细胞凋亡、炎症反应等多个方面的生物学过程,因此免疫平衡在维持胎儿生存和发育中发挥着重要的作用[8]。研究表明在自然流产的发生和发展中,Th1/Th2 免疫失衡可能是导致胚胎死亡和流产的重要因素之一。因此,Th1/Th2 免疫平衡可能是预防和治疗流产的新靶点[9]。

研究表明,通过纠正Th1/Th2 免疫因子失衡,自然流产患者的妊娠结局能得到明显改善[10]。Tbet 作为Th1 型免疫细胞的特异性转录因子,不仅能够促进Th1 型细胞分化;
还能诱导Th1 型经典细胞因子IFN-γ 的分泌[11]。Th2 型免疫细胞的特异性转录因子GATA-3,促进Th2 型免疫细胞发育的同时,还可以诱导Th2 型经典细胞因子IL-4 的分泌,同时还能一定程度地抑制Th1 型细胞的免疫反应[5]。

泰山磐石散是一种具有调节免疫功能的中药复方,已被证明具有调节免疫功能的作用[12-13]。本研究结果显示,泰山磐石散可下调自然流产模型大鼠蜕膜组织中T-bet 的蛋白表达水平,同时上调GATA-3 蛋白表达水平。而且经泰山磐石散治疗后大鼠蜕膜组织的免疫病理损伤明显改善。这可能因为Th2 型免疫应答占优势,而Th1 型免疫应答减弱。前期研究发现,泰山磐石散可下调自然流产模型大鼠血清中IFN-γ 的表达水平,而血清中IL-4的表达水平则明显上升[6]。综上,泰山磐石散可能是通过影响T-bet/GATA-3 信号通路,下调妊娠大鼠子宫蜕膜组织中T-bet 的蛋白表达水平,同时上调GATA-3 蛋白表达水平,从而抑制Th1 型免疫反应促进Th2 型免疫反应,从而调控Th1/Th2 免疫平衡以改善大鼠妊娠结局。

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