南极磷虾活性肽对非酒精性脂肪肝病模型的保护作用研究

骆鑫鑫，胡渝东，王 斌，赵玉勤

(浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022)

南极磷虾Euphausia superba 是一类属甲壳纲磷虾目的多年生海洋浮游甲壳动物，是地球上生物量最大、繁衍最成功的多细胞生物之一，因其资源丰富的特点而成为南极食物链和海洋生态系统中极为重要的组成部分[1]。南极磷虾生活方式以群居为主，这种特性使其在资源储藏量上显示出了巨大的优势[2]。南极磷虾具有高蛋白、低脂肪和矿物质含量丰富等特点，并且其庞大的生物量为其应用价值提供了坚实基础，成为天然的蛋白质资源，对人体具有较高的营养价值[3-4]。在保健品、食品和医学领域，南极磷虾在其中有着极大的应用潜力[5]。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种常见的慢性肝病[6]。它与人体代谢活动密切相关[7]，指人体在没有饮酒过量的情况下，肝脏组织中的脂肪含量占肝脏重量5%以上的病理状况。NAFLD 又被认为是代谢综合征在人体肝脏中的表现[8-9]，它与肥胖[10]、胰岛素抵抗(IR)[11]、糖尿病、血脂异常[12]以及体内氧化应激[13]和炎症[14]等疾病密切相关。目前认为，过量的游离脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)在肝脏中蓄积会导致脂质代谢稳态出现失衡，进而增加了肝脏的氧化应激水平以及炎症反应，使得肝细胞内的细胞器出现损伤和功能障碍。因此，减少肝脏内脂质沉积、减轻氧化应激反应和缓解炎症反应对于预防和治疗NAFLD 而言具有重要意义。

海洋生物活性肽是一类从海洋生物中提取出来由2～20 个氨基酸组成的蛋白质片段。海洋生物活性肽具有多样的生物活性，主要原因是活性肽的氨基酸组成及序列的不同[15]。近年来，研究发现海洋生物活性肽具有抗氧化[16]、抗肿瘤[17]、降血压[18]、降血脂[19]等多种活性，且具有高度专一性、毒性小和生物活性强等优点。因此，该研究采用南极磷虾活性肽为实验材料，通过建立体外NAFLD 细胞模型来探究南极磷虾活性肽保肝护肝活性及其作用机制，为南极磷虾活性肽资源的开发提供理论基础。

1.1 实验材料

1.1.1 生物材料

人肝癌细胞HepG2 购于中国科学院上海细胞库。

南极磷虾活性肽F1-F13，其氨基酸序列为Val-Asp-Lys(F1)，Val-Glu-Ala-Asp(F2)，Val-Ala-Lys-Arg-Ser(F3)，Val-Gly-Lys(F4)，Val-Gly-Lys-Trp(F5)，Ile-Asn-Lys(F6)，Ala-Ser-Gln(F7)，Ile-Asn-Lys-Trp-Trp(F8)，Ile-Met-Pro(F9)，Ile-Met-Pro-Lys-Asn(F10)，Phe-Leu-Ala(F11)，Lys-Ile-Thr(F12)，Val-Glu(F13)。

1.1.2 实验试剂

实验试剂见表1。

表1 实验试剂Tab.1 The experimental reagents

1.1.3 实验仪器

实验仪器见表2。

表2 实验仪器Tab.2 The experimental instruments

1.2 实验方法

1.2.1 体外NAFLD 细胞模型的建立

(1)细胞分组

取生长对数期的HepG2 细胞接种于不同孔板中，细胞分组如下：A：空白组：无血清DMEM 高糖培养基；
B：样品组：无血清DMEM 高糖培养基+不同浓度OA。实验中，96 孔板中为200 μL/孔，12 孔板中为1 mL/孔。

(2)OA 对HepG2 细胞活性的影响

取对数生长期的肝癌细胞(HepG2)接种于96 孔培养板中，置于37 ℃、5% CO2的恒温箱中孵育。待细胞贴壁生长后，将孔内的培养基吸弃，每孔加入180 μL 无血清的DMEM 高糖培养基进行饥饿12 h。之后分为空白组和样品组，空白组加入20 μL 无血清DMEM 高糖培养基，样品组加入不同浓度的OA(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L-1)20 μL，恒温细胞培养箱中培养24 h 后，每孔加MTT 溶液培养4 h，将孔内液体倒弃，孔内加入DMSO 避光震荡，之后在570 nm 波长处测定OD 值。MTT 法测细胞相对存活率，计算公式为：

(3) OA 对HepG2 细胞脂质堆积的影响

取HepG2 细胞接种于12 孔板中。细胞贴壁后，将孔内的培养基吸弃，每孔加入0.9 mL 无血清的DMEM 高糖培养基进行饥饿12 h。之后空白组加入100 μL 无血清DMEM 高糖培养基，样品组加入不同浓度OA(0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L-1)100 μL，继续培养24 h。

(4) OA 对HepG2 细胞甘油三酯(TG)含量的影响

细胞给药及处理同1.2.1-(3)。根据TG 测定试剂盒说明书，在96 孔板上设空白组、标准品组、样品组，后每孔加入工作液，37 ℃培养箱中孵育10 min。在510 nm 波长下读取吸光度。根据试剂盒说明书，计算出样本中甘油三酯的含量。

1.2.2 筛选对体外NAFLD 模型具有保护作用的南极磷虾活性肽

(1) 南极磷虾活性肽对HepG2 细胞活性的影响

实验步骤同1.2.1-(2)，南极磷虾活性肽F1-F13 浓度为300 μmol·L-1，作用时间为48 h。

(2) 细胞分组及给药

取处于生长对数期的HepG2 细胞接种于不同孔板中，细胞分组如下：

空白组：无血清DMEM 高糖培养基培养(饥饿)36 h；

模型组：饥饿培养12 h 后，加入OA(0.4 mmol·L-1)培养24 h；

阳性药组：饥饿培养时加入NAC(2 mmol·L-1)12 h，后加入OA(0.4 mmol·L-1)培养24 h；

南极磷虾活性肽组：饥饿培养时加入F1-F13(300 μmol·L-1)12 h，后加入OA(0.4 mmol·L-1)培养24 h。

(3) 南极磷虾活性肽对NAFLD 细胞模型TG 含量的影响

实验步骤同1.2.1-(4)。

1.2.3 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型降脂活性研究

(1) 细胞分组及给药

细胞分组中空白组、模型组、阳性药组同1.2.2-(2)；
南极磷虾活性肽组：饥饿培养时加入F13(100、200、300 μmol·L-1)12 h，后加入OA(0.4 mmol·L-1)培养24 h。

(2) 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型脂质堆积的影响

细胞分组及给药同1.2.3-(1)，实验步骤同1.2.1-(3)。

(3) 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型TG 的影响

细胞分组及给药同1.2.3-(1)，实验步骤同1.2.1-(4)。

(4) 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型胆固醇(TC)含量的影响

细胞分组及给药同1.2.3-(1)，根据T-CHO 测定试剂盒说明，在96 孔板中设空白组、标准品组、样品组，后每孔加入工作液，37 ℃培养箱中孵育10 min。在510 nm 波长下读取吸光度。根据试剂盒说明书，计算出样本中胆固醇的含量。

式中：OD样本为样本吸光度；
OD空白为空白组吸光度值；
C校准为标准品浓度，mmol·mL-1。

1.2.4 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型抗氧化活性研究

(1) 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型活性氧(ROS)含量的影响

取HepG2 细胞接种于96 孔培养板。置于细胞孵育恒温箱中孵育24 h。细胞分组及给药同1.2.3-(1)，后弃去培养液用PBS 洗涤2 次，加入10 μmol·L-1DCFH-DA 荧光探针溶液，孵育1 h 后，用PBS 洗涤2 次，放置于暗室中，通过荧光倒置显微镜观察、拍摄细胞荧光情况。使用酶标仪测定光强(激发波长为485 nm/发射波长为535 nm)。

(2) 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型过氧化氢酶(CAT)活力的影响

细胞分组及给药同1.2.3-(1)，实验步骤参照表3。

表3 CAT 活力测定操作表Tab.3 CAT vitality measurement operation table

上述试剂混匀，在紫外波长405 nm 处，测定吸光度。计算公式如下所示：

(3) 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响

细胞分组及给药同1.2.3-(1)，实验步骤见表4。

表4 SOD 活力测定操作表Tab.4 SOD vitality measurement operation table

计算公式：

(4) 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型丙二醛(MDA)含量的影响

细胞分组及给药同1.2.3-(1)，实验步骤见表5。

表5 MDA 含量试剂盒测定操作表Tab.5 Operation table for determining MDA content kit

离心管盖上后，刺出小孔，振荡混匀，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷却，离心取上清，在532 nm 处测定吸光度。

(5) 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响

细胞分组及给药同1.2.3-(1)，实验步骤见表6、7。

表6 GSH-Px 活力测定操作表(一)Tab.6 GSH-Px activity test operation table (1)

表7 GSH-Px 活力测定操作表(二)Tab.7 GSH-Px activity test operation table (2)

混匀后，静置15 min，在紫外波长412 nm 处测吸光度。计算公式如下：

2.1 体外NAFLD 细胞模型的建立

2.1.1 OA 对HepG2 细胞活性的影响

以不添加OA 的细胞(空白组)活性为100%，将0.2～0.8 mmol·L-1OA 处理预先饥饿12 h 的HepG2细胞24 h，细胞活性见图1。

图1 OA 浓度对细胞活性的影响Fig.1 Effect of OA concentrationon the activity in HepG2 cells

由图1 可知，HepG2 细胞的活性随着OA 浓度增加而呈现下降趋势。通常细胞存活率大于90%被认为细胞生长未受到明显影响。0.4 mmol·L-1OA 处理的HepG2 细胞的活性为102.25%±1.88%，与空白组之间无显著差异(P＞0.05)。而0.6～0.8 mmol·L-1OA 处理的HepG2 细胞的活性降至86.55%±3.14%和23.88%±1.44%，且与空白组之间存在极显著差异(P＜0.001)。因此，OA 浓度在0.4 mmol·L-1以内时对HepG2细胞无明显的毒性作用。

2.1.2 OA 对HepG2 细胞脂质堆积的影响

采用油红O 染色法评价细胞内脂质变性程度。如图2 所示，不添加OA 的HepG2 细胞内未观察到明显的红色脂滴，而加入不同浓度的OA 后，细胞内的红色脂滴数量增加，与空白组有明显差异。而随着OA 浓度(0.4～0.8 mmol·L-1)的增加，细胞内红色脂滴的数量以浓度依赖性方式增加，且具有极显著性统计学意义(P＜0.001)。测得吸光度与脂滴数量趋势一致。其中，0.4 mmol·L-1OA 诱导的细胞内存在大量红色脂滴，说明细胞内脂肪沉积明显。

图2 OA 对HepG2 细胞内脂质堆积的影响Fig.2 Effect of OA on intracellular lipid accumulation in HepG2 cells

2.1.3 OA 对HepG2 细胞甘油三酯(TG)含量的影响

通过TG 含量试剂盒检测方法来定量评价HepG2 细胞脂质沉积的程度。如图3 所示，可以明显看出随着OA 浓度的增加，HepG2 细胞内TG 含量逐渐增加。不添加OA 的HepG2 细胞内TG 含量仅为(0.017±0.003) mmol·gprot-1，而当加入0.4 mmol·L-1OA 时，HepG2 细胞内TG 含量与空白组之间存在极显著差异(P＜0.001)，增加至(0.045±0.002) mmol·gprot-1。以上数据说明0.4 mmol·L-1OA 诱导能够显著增加HepG2 细胞内TG 含量，从而造成细胞内脂质蓄积。

图3 OA 对HepG2 细胞内TG 含量的影响Fig.3 Effect of OA on TG content in HepG2 cells

实验结果表明：0.4 mmol·L-1及以下浓度的OA 培养细胞24 h 后对细胞活性无明显影响，而0.4 mmol·L-1以上浓度的OA 对细胞有明显毒性作用，细胞存活率降至90%以下；
通过油红O 染色实验，观察到不同浓度的OA 均可诱导细胞内的脂质堆积。但0.2 mmol·L-1OA 组细胞内仅有少量脂滴存在；
而0.4 mmol·L-1OA 组细胞内红色脂滴较多并呈环状位于胞内，且与空白组之间存在极显著性差异(P＜0.001)；
之后检测细胞内TG 含量，结果表明0.4 mmol·L-1OA 组细胞内TG 含量明显升高，且与空白组之间存在极显著性差异(P＜0.001)。因此，选用对细胞活性无明显影响且脂质堆积明显的0.4 mmol·L-1OA 浓度作为后续实验的造模液浓度。

2.2 筛选对体外NAFLD 模型具有保护作用的南极磷虾活性肽

2.2.1 南极磷虾活性肽对HepG2 细胞活性的影响

样品组加入300 μmol·L-1活性肽(F1-F13)作用细胞48 h，空白组正常培养。以MTT 测定各实验组细胞存活率，当细胞存活率在90%上被认为对细胞无毒性作用。结果见图4，13 条活性肽均对HepG2 细胞无明显毒性作用。

图4 南极磷虾活性肽(F1-F13)对细胞活性的影响Fig.4 Effect of F1-F13 on the activity in HepG2 cells

图5 F1-F13 对HepG2 细胞内TG 含量的影响Fig.5 Effect of F1-F13 on TG content in HepG2 cells

2.2.2 南极磷虾活性肽对NAFLD 细胞模型TG 含量的影响

通过TG 试剂盒检测方法评价13 条南极磷虾肽对OA 诱导的HepG2 细胞中TG 含量的影响。由图5 所示，与空白组相比较，0.4 mmol·L-1OA 处理的细胞中TG 含量显著增加(P＜0.001)。随着300 μmol·L-1不同活性肽的加入，F8、F9、F13 组细胞中TG 均有减少的趋势，且与模型组之间存在显著性差异。其他组细胞TG 含量则不存在显著性差异(P＞0.05)。因此，选择实验结果中极显著降低TG 含量的F13 活性肽进行后续实验(P＜0.001)。

2.3 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型降脂活性研究

2.3.1 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型脂质堆积的影响

通过油红O 染色实验观察F13 100～300 μmol·L-1浓度对OA 诱导的HepG2 细胞中脂质蓄积的影响，并在染色完成后加入异丙醇，在570 nm 下测定吸光度。如图6 所示，与模型组相比较，F13 在浓度为100 μmol·L-1时，细胞内的脂质堆积并无明显减少(P＞0.05)。F13 在浓度为200 μmol·L-1时，细胞内的脂质堆积含量极显著减少(P＜0.001)；
当F13 浓度为300 μmol·L-1时，细胞内的脂质堆积程度极显著减轻(P＜0.001)。如图6 所示，样品组HepG2 细胞内脂质堆积程度随着肽浓度的增加而减轻，且呈现浓度依赖性。

图6 不同浓度F13 对HepG2 细胞内脂质堆积的影响Fig.6 Effect of F13 at different concentration intracellular lipid accumulation in HepG2 cells

2.3.2 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型TG的影响

通过TG 试剂盒测定法来评价F13 在100～300 μmol·L-1浓度下对OA 诱导的HepG2 细胞中甘油三酯含量的影响。由图7 所示，与模型组相比较，F13 在浓度为100 μmol·L-1时，细胞内的TG含量明显减少(P＜0.05)；
F13 在浓度为200 μmol·L-1时，细胞内的TG 含量较显著降低(P＜0.01)，当F13 浓度为300 μmol·L-1时，细胞内的TG 含量极显著降低(P＜0.001)。由图示可知，随着肽浓度的增加，样品组HepG2 细胞内TG 含量逐渐减少，且呈现浓度依赖性。

图7 不同浓度F13 对HepG2 细胞内TG 含量的影响Fig.7 Effect of F13 at different concentrationson TG content in HepG2 cells

2.3.3 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型TC含量的影响

通过TC 试剂盒测定法来评价F13 在100～300 μmol·L-1浓度下对OA 诱导的HepG2 细胞中胆固醇含量的影响。由图8 所示，相较于模型组，F13 在浓度为100 μmol·L-1时，细胞内的TC含量显著降低(P＜0.05)；
F13 浓度为200 μmol·L-1和300 μmol·L-1时，细胞内的TC 含量极显著降低(P＜0.001)。如图8 所示，随着肽浓度的增加，样品组HepG2 细胞内TC 含量逐渐减少，且呈现浓度依赖性。

图8 不同浓度F13 对HepG2 细胞内TC 含量的影响Fig.8 Effect of F13 at different concentrationson TC content in HepG2 cells

2.4 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型抗氧化活性研究

2.4.1 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型活性氧(ROS)含量的影响

通过DCFH-DA 染色法观察并计算F13 在100～300 μmol·L-1浓度下对OA 诱导的HepG2 细胞中活性氧含量变化。如图9 所示，相较于模型组，F13 在浓度为100 μmol·L-1时，细胞内的ROS 含量显著降低(P＜0.05)；
F13 浓度为200 μmol·L-1和300 μmol·L-1时，细胞内的ROS 含量极显著降低(P＜0.001)。由图示可知，随着肽浓度的增加，样品组HepG2 细胞内ROS 含量逐渐减少，且呈现浓度依赖性。

图9 不同浓度F13 对HepG2 细胞内ROS 含量的影响Fig.9 Effect of F13 at different concentrationson ROS content in HepG2 cells

2.4.2 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型过氧化氢酶(CAT)活力的影响

通过CAT 试剂盒测定法来评价F13 在100～300 μmol·L-1浓度下对OA 诱导的HepG2 细胞中过氧化氢酶活力的影响。由图10 所示，相较于模型组，F13 在浓度为100 μmol·L-1时，细胞内的CAT 含量显著升高(P＜0.05)；
F13 浓度为200 μmol·L-1和300 μmol·L-1时，细胞内的CAT 含量极显著升高(P＜0.001)。由图示可知，随着肽浓度的增加，样品组HepG2 细胞内CAT 含量也随之增加，且呈现浓度依赖性。

图10 不同浓度下F13 对HepG2 细胞中CAT 活力的影响Fig.10 Effect of F13 at different concentrations on CAT activity in HepG2 cells

2.4.3 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响

通过SOD 试剂盒测定法来评价F13 在100～300 μmol·L-1浓度下对OA 诱导的HepG2 细胞中超氧化物歧化酶活力的影响。如图11 所示，相较于模型组，F13 在浓度为100 μmol·L-1时，细胞内的SOD 含量明显增加(P＜0.05)；
F13 浓度为200 μmol·L-1和300 μmol·L-1时，细胞内的SOD 含量极显著增加(P＜0.001)。由图示可知，随着肽浓度的增加，样品组HepG2 细胞内SOD 含量也随之增加，且呈现浓度依赖性。

图11 不同浓度下F13 对HepG2 细胞中SOD 活力的影响Fig.11 Effect of F13 at different concentrations on SOD activity in HepG2 cells

2.4.4 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型丙二醛(MDA)含量的影响

通过MDA 试剂盒测定法来评价F13 在100～300 μmol·L-1浓度下对OA 诱导的HepG2 细胞内丙二醛含量的影响。如图12 所示，相较于模型组，F13 在浓度为100 μmol·L-1时，细胞内的MDA 含量明显减少(P＜0.05)；
当F13 浓度为200 μmol·L-1和300 μmol·L-1时，细胞内的MDA 含量极显著降低(P＜0.001)。由图示可知，随着肽浓度的增加，样品组HepG2 细胞内MDA 含量逐渐减少，且呈现浓度依赖性。

图12 不同浓度下F13 对HepG2 细胞中MDA 含量的影响Fig.12 Effect of F13 at different concentrations on MDA content in HepG2 cells

2.4.5 南极磷虾活性肽对体外NAFLD 模型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响

通过GSH-Px 试剂盒测定法来评价F13 在100～300 μmol·L-1浓度下对OA 诱导的HepG2 细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响。如图13 所示，相较于模型组，F13 在浓度为100 μmol·L-1时，细胞内的GSH-Px 含量较显著升高(P＜0.01)；
当F13 浓度为200 μmol·L-1和300 μmol·L-1时，细胞内的GSH-Px 含量极显著升高(P＜0.001)。由图示可知，随着肽浓度的增加，样品组HepG2 细胞内GSH-Px 含量逐渐升高，且呈浓度依赖性。

图13 不同浓度下F13 对HepG2 细胞中GSH-Px 活力的影响Fig.13 Effect of F13 at different concentrations onGSH-Px activity in HepG2 cells

该研究利用HepG2 细胞建立非酒精性脂肪肝体外模型，对南极磷虾活性肽进行筛选和活性研究，并对其保肝护肝作用机制进行探讨。利用油红O 染色实验和TG 试剂盒检测得出0.4 mmol·L-1OA 能够显著增加细胞内的脂质堆积和TG 含量。因此，选用对细胞活性无明显影响且诱导脂质堆积明显的0.4 mmol·L-1OA 作为建立体外NAFLD 细胞模型的最佳浓度。进一步利用油红O 染色实验以及TG、TC 含量试剂盒来评价筛选得到的南极磷虾活性肽Val-Glu (F13)的降脂活性；
利用DCFH-DA 荧光探针检测细胞内ROS 水平；
测定NAFLD 细胞模型中MDA 含量、CAT、SOD 及GSH-Px 活力来评价南极磷虾活性肽Val-Glu 的抗氧化活性；
显示出南极磷虾活性肽Val-Glu 具有良好的降脂、抗氧化等体外NAFLD 细胞模型保护作用，为南极磷虾的高值化利用、功能性食品和新型保肝护肝药物的研发提供了理论基础。

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