经皮耳穴-迷走神经刺激对2型糖尿病大鼠学习记忆能力和认知功能的影响

薛 娇,马鹏垒,丁玉美,王彩霞

(内蒙古医科大学第二附属医院,内蒙古 呼和浩特 010090)

随着社会经济的发展和全球老龄化人口的增加,老年糖尿病的人群越来越多,而糖尿病患者发生认知功能障碍的概率为正常人群的3倍左右[1]。Jacobs等[2]研究发现,迷走神经刺激可以改善老年人的记忆力。耳甲区是人体体表分布迷走神经的特有区域,刺激该区域可以通过激活迷走神经的耳支,将信号上传到中枢神经系统,最终来调控呼吸循环系统和消化系统等外周器官[3]。相关研究显示,经皮耳穴迷走神经刺激可改善轻度认知障碍患者的整体认知功能,其中情景记忆和执行功能改善尤为明显,机制可能与耳穴刺激海马突触可塑性有关[4-5]。本研究基于炎症反应和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路探讨了经皮耳穴迷走神经刺激对2型糖尿病大鼠学习记忆以及认知功能的影响,以为该方法的临床应用提供理论依据。

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠32只,5～6周龄,体重160～200 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号:SYXK(蒙)2020-0003。本动物实验经内蒙古医科大学第二附属医院医学伦理委员会审核批准(EFY20230005)。动物饲养于标准的饲养条件下,温度(25±2)℃、湿度(50±5)%,维持固定的光照-黑暗周期(12 h),供给充足的洁净饮用水和大鼠专用饲料、垫料。

1.2试剂与仪器 苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(上海嘉楚,R100458),ECL超敏发光试剂盒(Oriscience,PD202),BCA 蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝,PC0020),大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫试剂盒(北京索莱宝,SEKR0009),蛋白提取液(MDL,MDL91201),蛋白酶抑制剂(MDL,MD912893),PI3K抗体(BIOSS,bs-128R),Akt抗体(BIOSS,bs-0115R),β-actin抗体(BIOSS,bs-0061R);Morris水迷宫(中国软隆科技),包埋机(德国Leica),韩氏穴位电刺激治疗仪(南京济生医疗),光学显微镜、透射电镜(日本Hitachi),台式高速冷冻离心机(美国THERMO),电泳系统(美国BIORAD),恒温箱(上海新苗),精密电子天平(德国Sartorius),PowerPac Universal电泳仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad),脱色摇床(TS-100海门其林贝尔),酶标仪(瑞士帝肯),刀片、咬骨钳、组织剪(康洪医疗器械)。

1.3实验方法 将32只大鼠随机分为空白组、模型组、耳缘非迷走神经刺激组、耳穴迷走神经刺激组。除空白组外,其余组大鼠均参照文献[6]方法给予高糖高脂饮食6周后单次腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素制备2型糖尿病模型,注射3 d后测得大鼠尾静脉随机血糖>16.7 mmol/L提示造模成功。造模2周后,每天于应激前1 h,耳穴迷走神经刺激组在大鼠双侧耳甲腔进行电刺激,耳缘非迷走神经刺激组在大鼠双侧耳缘处进行电刺激,刺激强度均为2 mA,频率2 Hz/15 Hz,每次30 min,1次/d,持续3周;空白组和模型组不给予电刺激。

1.4检测指标及方法

1.4.1空间学习记忆能力 末次刺激结束后,实施Morris水迷宫实验。准备直径1.2 m水池、直径10 cm平台,水温保持(26+2)℃。实验的前4 d进行隐匿平台实验,每天每只大鼠进行4次实验,分别从不同象限入水,记录找到平台的时间,时限120 s,最终第4天的时间即为逃避潜伏期;隐匿平台实验后24 h进行空间探索实验,即去掉平台,观察2 min内大鼠穿越平台的总次数。

1.4.2海马组织形态 水迷宫实验结束后,腹腔注射3%的戊巴比妥钠150 mg/kg后,断头开颅取出全脑,于冷冻台上剥离海马组织。一侧置于4%甲醛溶液中固定,乙醇脱水后石蜡包埋后制成4 μm厚切片,最后干燥脱蜡进行常规HE染色。

1.4.3海马组织中TNF-α含量 剪取大鼠部分海马组织,制作成匀浆,采用ELISA试剂盒,严格参照说明书步骤测得海马区TNF-α的含量。

1.4.4海马组织中PI3K、Akt蛋白表达情况 取冻存大脑海马组织,制作成匀浆,收集上清液,运用Western blot法测定总蛋白的浓度,根据测定的浓度制备电泳凝胶;使用三明治夹心法进行转膜,结束后用5%的脱脂奶粉液在室温下进行封闭1.5 h,结束后放入TBST洗3次;稀释一抗,置于4 ℃孵育,摇床过夜,结束后置于TBST洗膜3次;次日稀释二抗,置于室温孵育,摇床2 h,TBST洗膜3次;用ECL化学发光试剂盒进行显影,以目的蛋白与内参蛋白(β-actin)条带灰度值的比值反映目的蛋白的相对表达量。

1.5统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据统计分析,计量资料均呈正态分布,多组比较用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,以α=0.05为检验水准。

2.1各组大鼠学习记忆能力比较 与空白组比较,模型组和耳缘非迷走神经刺激组大鼠逃避潜伏期均明显延长(P均<0.05),穿越平台次数均明显减少(P均<0.05);与模型组和耳缘非迷走神经刺激组比较,耳穴迷走神经刺激组大鼠水迷宫逃避潜伏期明显缩短(P均<0.05),穿越平台次数明显增多(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和2型糖尿病各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数比较

2.2各组大鼠海马组织病理形态比较 空白组大鼠海马组织结构正常,细胞分布排列有序,胞核形态大小适中;模型组、耳缘非迷走神经刺激组大鼠海马组织细胞明显减少,排列紊乱,部分细胞形态遭到破坏,胞核消失,胞体皱缩;耳穴迷走神经刺激组大鼠海马组织细胞排列基本正常,形态相对完整,局部可见少量的胞核发生固缩。见图1。

图1 空白组和2型糖尿病各组大鼠海马组织形态(HE染色,×200)

2.3各组大鼠海马组织中TNF-α含量比较 模型组大鼠海马组织中TNF-α含量明显高于正常组(P<0.05);耳穴迷走神经刺激组大鼠海马组织中TNF-α含量明显低于模型组(P<0.05);耳缘非迷走神经刺激组大鼠海马组织中TNF-α含量较模型组降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 空白组和2型糖尿病各组大鼠海马组织中TNF-α含量

2.4各组大鼠海马组织中PI3K、Akt蛋白表达情况比较 模型组大鼠海马组织中PI3K、Akt蛋白相对表达量均明显低于空白组(P均<0.05);耳穴迷走神经刺激组大鼠海马组织中PI3K、Akt蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05),耳缘非迷走神经刺激组大鼠海马组织中PI3K、Akt蛋白相对表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

图3 空白组和2型糖尿病各组大鼠海马组织中PI3K、Akt蛋白表达情况比较

糖尿病对于大脑认知功能方面有着潜在的不良影响,严重者会导致认知功能障碍。目前研究认为,糖尿病与认知功能障碍之间关联的可能机制包括糖脂代谢紊乱、中枢炎症、神经元凋亡、血脑屏障受损和神经递质紊乱等[7]。因此,防止糖尿病患者发生认知功能障碍要从两者之间的机制着手,探索最佳的干预方法。

颈部迷走神经刺激术是治疗癫痫和难治性抑郁症的一种有效措施[8],但放置电刺激器需要暴露颈部的迷走神经,属于有创操作,感染风险较高,不易被患者所接纳。近年来大量研究证实,经皮耳穴迷走神经刺激作为一种融合中西医优势的治疗技术,其作用效果几乎与传统的颈部迷走神经刺激术相同,且操作简便,不需要有创操作[3,9]。耳甲区又称内脏代表区,经皮耳穴迷走神经刺激的部位是以耳穴“心”为主的位置,即迷走神经耳支,通过激活迷走神经耳支可以把信息传递到孤束核,进而投射到脑区,发挥中枢抗炎效应[10];且可以促使耳甲区的迷走神经传入通路更快地到达中枢,发出更多的传出性神经冲动,进而直接或间接激活抗炎途径,减少炎症因子的释放,最终抑制中枢的炎症反应来改善认知功能[11],但经皮耳穴迷走神经刺激对糖尿病认知功能的影响及作用机制尚不清楚。

Morris水迷宫实验是评估动物模型空间学习记忆和认知功能的主要方法[12]。本实验中大鼠Morris水迷宫实验证实2型糖尿病大鼠出现学习记忆障碍;耳穴迷走神经刺激组大鼠的逃避潜伏期和平台穿越次数均较模型组明显改善,说明经皮耳穴迷走神经刺激可以有效改善2型糖尿病大鼠的学习记忆能力。

糖尿病的高糖状态可通过多种途径激活全身的炎症反应,中枢炎症反应的产生又会进一步促进神经炎性因子的释放,损伤神经细胞,进而影响认知功能[13]。TNF-α是一种具有稳态、免疫和炎症作用的多效性细胞因子,是第一个被认为参与2型糖尿病发病机制的促炎细胞因子,其表达异常可能影响大脑突触可塑性[13-14]。本实验结果显示,模型组大鼠海马组织中TNF-α含量明显升高,耳穴迷走神经刺激组大鼠海马组织中TNF-α含量较模型组明显降低,表明经皮耳穴迷走神经刺激能通过抑制炎症反应来改善认知功能。

PI3K/Akt信号通路是一种胞内信号转导通路,Akt是P13K的下游蛋白,Akt被激活后可以调控多种通路,影响体内糖代谢、神经细胞的活化状态[15];激活PI3K/Akt信号通路,可以抑制海马区神经细胞的凋亡[16]。本实验结果显示,耳穴迷走神经刺激组海马组织中PI3K、Akt蛋白相对表达量均较模型组明显升高,说明经皮耳穴迷走神经刺激可能通过上调PI3K、Akt的表达而发挥对糖尿病大鼠海马神经元的保护作用。

综上所述,经皮耳穴迷走神经刺激可能通过抑制炎症反应,激活PI3K/Akt信号通路保护海马区的神经细胞而改善2型糖尿病大鼠的学习能力和认知功能,为该方法的临床应用提供了新的实验依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。

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