秸秆堆肥功能微生物与高效降解菌剂的研究进展

王 鑫，彭仕乐，张旭屹，张宏森，毛国涛，谢 慧*，宋安东

（河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002）

中国秸秆资源丰富，玉米、小麦和水稻等可收集农作物的秸秆年产量约7亿t。截至2022年10月，全国农作物秸秆利用量达6.47亿t，综合利用率为88.1%[1]，包括生物降解、饲料加工、气化、造纸工艺等。目前，美国、日本、丹麦及澳大利亚等国家除了将秸秆用作饲料与能源外，大量的秸秆被以还田的方式作为肥料使用[2]。而我国秸秆资源同样以肥料化和饲料化利用方式为主，约占所有秸秆利用方式的77.5%[3]。秸秆还田不仅有利于提高土壤有机质含量、改善土壤物理结构及促进土壤微生物的生长繁殖，还能够替代部分化学氮肥施用，降低农业生产成本。秸秆还田养分理论当季归还量（化肥可替代量）年均值近300万t。利用高温堆肥发酵制备有机肥是对秸秆最有效利用的方法之一，其可有效减少因秸秆高强度直接还田所引起的病虫害加剧的风险。

秸秆堆肥的腐熟过程是由多种微生物主导的，对复杂有机物质的生物降解过程[4]，也是由各类功能微生物分泌多种酶对其进行生物降解，所以该过程也是一个复杂的酶学过程，需要多种酶的协同作用来完成[5]。在堆肥过程中微生物的变化为：在堆肥初期，细菌和丝状真菌开始快速分解易降解的有机物（蛋白质、淀粉类物质、简单的糖类）并产生大量热量。当堆体进入高温时期（50 ℃）后，除部分残留下来的以及新形成的水溶性有机物继续分解外，复杂有机物（纤维素、半纤维素）也进行了强烈的分解，该阶段以高温微生物活动为主。当堆体温度达到60 ℃后，嗜热放线菌（Thermophilic actinomycetes）和芽孢杆菌属（Bacillus）成为主要菌群，而好热丝状真菌几乎全部停止活动。当堆体温度达到70 ℃以上，只有好热芽孢杆菌在活动，其他微生物大量死亡或进入休眠状态，堆体温度开始下降，当下降到适当温度时，休眠状态的好热微生物恢复生命活动，堆体温度又会再次上升[6]。因此，使秸秆堆肥高效腐熟的关键在于明晰所采用堆肥材料的结构特性及堆肥过程中各类关键微生物的具体功能。

本文详细介绍了秸秆降解的功能微生物、高效降解菌剂及其应用效果，阐述了多种功能微生物在降解秸秆间的协同作用，并对多功能秸秆降解菌剂的研究现状和存在问题进行分析，为今后开发高效多效秸秆降解菌剂提供了理论基础。

秸秆中纤维素、半纤维素及木质素含量高，结构复杂，微生物难以利用，因此加快木质纤维素的降解是提高堆肥腐熟进程的关键。据报道，秸秆堆肥中具有木质纤维素降解功能的微生物主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）等[7-8]。其中，Bacillus在堆肥前期降解纤维素及木质素具有主要贡献[9]，而嗜热真菌在秸秆堆肥过程中对复杂聚合物具有较强的降解能力，在高温阶段，Aspergillus在真菌群落中占据主导地位[10]。而ANTUNES L P等[11]研究发现，在高温堆肥温度超过65 ℃时很难检测到真菌，这表明在堆肥高温阶段真菌的降解活性和细菌相比微不足道，因此，细菌是堆肥升温和高温阶段的主要降解菌，而真菌的降解作用主要集中在冷却与固化阶段。

秸秆分解的主要过程是利用功能微生物对各种有机质进行转化，包括以下三个过程：第一阶段主要以细菌为主，利用秸秆中的可溶性营养物质繁殖，并积累腐殖质；
第二阶段则是以真菌的快速分解木质素为主；
第三阶段以放线菌的作用为主，开始对前期积累的腐殖质进行分解[12]。

1.1 细菌在秸秆堆肥中的功能与作用

GAVANDE P V等[13]研究发现，厚壁菌门（Firmicutes）中Bacillus在半纤维素的降解中起重要作用，而变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）分别可以促进纤维素和木质素的降解。目前针对加速秸秆腐熟研究较多的芽孢杆菌属，包括解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliticus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）等[14-18]，如表1所示。ZHANG S B等[9]在水稻秸秆堆肥中分别接种暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）、B.licheniformis及嗜碱芽孢杆菌（Bacillus basophilus），发现芽孢杆菌的作用类似于群落演替中的先锋细菌，在堆肥初期改善堆肥中的微环境，并使那些资源获取能力强的微生物大量繁殖，微生物群落分解木质纤维素的能力增强从而缩短堆肥周期。李红亚等[14]通过傅立叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）和核磁共振氢谱（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）等分析接种B.amyloliticus后对玉米秸秆降解的影响，发现接种后的处理组在甲基、亚甲基和羰基的吸收峰强度均低于空白对照，木质纤维素分子结构中的主要共价键、木质素与碳水化合物的连接键和碳水化合物中糖环内的共价键出现明显断裂，说明B.amyloliticus可将玉米秸秆中的多糖结构降解为还原性单糖，并利用这些单糖进行自身的生物代谢。

表1 秸秆堆肥的主要细菌及其作用Table 1 Main bacterial species and their functions in straw composting

表2 秸秆堆肥的主要真菌及其作用Table 2 Main fungal species and their functions in straw composting

目前，能够降解秸秆的放线菌主要是Streptomyces，其可以产生更高活性的纤维素酶。徐杰等[19]在水稻堆肥中添加灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens），发现接种S.griseorubens的堆肥在第3天进入高温期（＞45 ℃），高温持续17 d。自然堆肥在第4天进入高温期，高温仅持续10 d。木质素、纤维素和半纤维素的大幅降解也发生在高温期，分别比自然堆肥提高29.94%、18.78%、12.77%。结果表明，接种放线菌后不仅显著延长高温期，更重要的是加快堆肥中木质纤维素的降解。刘晓飞等[20]从寒地黑土腐殖质中筛选出一株具有高效降解纤维素能力的放线菌，经鉴定该菌株为链霉菌（Streptomycessp.），将该菌株接种于玉米秸秆液态发酵第7天时的降解率为17.8%。玉米秸秆红外光谱的结果表明该链霉菌可有效降解玉米秸秆中的纤维素和半纤维素成分。

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）在秸秆降解方面也起到非常重要的作用。王旭辉等[21]在赫奇逊氏无机盐培养基中添加玉米秸秆纤维素并接种1株P.fluorescens，发现该菌株对玉米秸秆纤维素的降解率达到45.4%。周俊强等[22]通过滤纸条崩解实验，发现P.fluorescens对麸皮和滤纸的降解率分别达到45.0%和33.3%，表明该菌株具有较强的纤维素降解能力。张鑫鹏等[23]在土壤中分离出1株具有纤维素降解能力的假单胞菌（Pseudomonassp.），在油菜秸秆堆肥试验中，发现添加该菌株的堆体在第1天就进入高温阶段（＞45 ℃），堆体温度维持在50 ℃以上的时间为26 d，具有堆体升温快，高温时间长的特点，从而加快堆肥腐熟并提高堆肥质量。

1.2 真菌在秸秆堆肥中的作用

真菌在秸秆堆肥过程中主要起到分解与维持物料稳定的作用。相比于细菌，真菌不仅可以分泌能降解纤维素、半纤维素和木质素的胞外酶，其菌丝还具备机械穿插作用，可以破坏秸秆的天然结构，更易降解秸秆，因此在秸秆降解方面受到国内外学者的普遍关注。

木霉属（Trichoderma）能够产生完整的纤维素酶系，具有溶解天然纤维素的作用，同时其属中被广泛应用在农作物产品上的生防菌，对作物生长发育条件也非常友好。里氏木霉（Trichoderma reedi）、长枝木霉（Trichoderma longiformis）、绿色木霉（Trichoderma viridis）及康氏木霉（Trichoderma koni）等真菌在秸秆的发酵领域中应用较多，如T.reedi可产生多种分解酶来降解秸秆。SARANGI S等[26]在水稻秸秆堆肥中接种里氏木霉NRRIT-26和NRRIT-27，发现不仅可以提高堆肥品质，且提高了水稻幼苗的活力及总叶绿素含量。李立波等[15]在玉米秸秆堆肥中接种了一株哈茨木霉（Trichoderma harzianum），固态发酵12 d时纤维素酶活达到3.61 FPU/mL，25 d后纤维素降解21.79%，同时T.harzianum还是一种可以抑制土壤及植物病原菌的有益菌[27]。

作为真菌的重要组成部分，曲霉属（Aspergillus）在提高秸秆堆肥腐熟进程方面同样发挥着不可忽视的作用。研究报道，黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、亮白曲霉（Aspergillus albus）等可降解纤维素、半纤维素和木质素[28-29]。陈露露[30]分析了接种A.fumigatus对玉米秸秆降解的影响，结果表明，A.fumigatus能分泌β-葡萄糖苷酶、羧甲基纤维素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）、滤纸酶和过氧化氢等多种木质纤维素酶，发酵第60天时秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素分别降低了44.78%、33.86%和52.22%，A.fumigatus具备良好的木质素降解能力。杨娜等[31]在自然秸秆堆肥样品中筛选到一株A.niger，经测试，其滤纸酶活为17.7 U/mL，β-葡聚糖苷酶活为79.26 U/mL，显著高于实验中其他降解菌，具有高效的纤维素降解能力。

青霉菌（Penicilliumsp.）是一种重要的木质纤维素降解菌。目前，有关青霉菌降解木质纤维素的研究主要集中在木质素过氧化物酶和漆酶的合成机理与条件优化方面。赵玉鑫等[32]在青霉菌（Penicilliumsp.）对玉米秸秆复合菌系好氧发酵的影响中发现，接种青霉菌可以有效提高漆酶的活性，从而提高秸秆复合菌系对木质纤维素的降解，但对木质素过氧化物酶的活性有不利影响。赵旭等[33]筛选到一株Penicilliumsp.，其滤纸酶活为29.6 U/mL，纤维素酶酶活为31.5 U/mL，在玉米秸秆降解实验中发现，接种青霉菌的处理组纤维素、半纤维素与木质素含量较空白对照均有减少，最终降解率为29.8%，表明青霉菌在秸秆降解方面具有巨大潜力。

近年来，许多研究人员针对秸秆中木质素难以降解的现状，陆续分离出了一些木质素降解能力极为显著的微生物。其中白腐菌（Phlebia）是担子菌亚门中的一类大型真菌，也是已知能将木质素彻底降解为二氧化碳和水的唯一生物。其作用机制是一个以自由基为基础所进行的链式反应过程，过氧化物酶、锰过氧化物酶以及木质素过氧化物酶对整个反应过程的启动和催化起着关键作用[34]。目前，关于利用白腐菌加速秸秆降解的研究较多的菌株包括香菇（Lentinus）、云芝（Polystictus）和侧耳（Pleurotus）[35-36]。

2.1 秸秆堆肥体系中微生物的多样性

秸秆堆肥腐熟过程实际是由多种微生物共同主导的发酵过程，且微生物菌群的数量及多样性会随堆肥时期的变化而改变[43]。在升温期，优势菌群包括Bacillus和假单孢菌属（Pseudomonas）等，该阶段内易降解的有机物快速分解为二氧化碳和水，难降解的有机物（纤维素、半纤维素及木质素）开始缓慢降解[44]；
进入高温期后，优势菌群转变为高温双歧菌属（Thermobifida）、Aspergillus、Bacillus等[45]；
随着高温期结束，堆体内营养物质匮乏，该阶段的优势微生物活动减弱，堆体温度下降进入降温阶段及腐熟阶段，该阶段内嗜温微生物重新占据主导地位，并开始继续分解难降解的有机物，这个时期优势菌群包括棒状杆菌属（Corynebacterium）、束村氏菌属（Tsukamurelia）、Bacillus、Streptomyces、小单孢菌属（Micromonospora）等[46]。孟庆欣[44]在对牛粪玉米堆肥中微生物群落演替的研究中发现，堆肥各个时期中细菌群落的超1（Chao1）指数呈现先升高后降低的趋势，并在升温期达到最大值；
辛普森（Simpson）指数呈现先降低后升高的趋势，说明在堆肥的升温期，细菌的丰富度和多样性均显著提升，进入高温期后缓慢下降，在腐熟期细菌的多样性显著下降，并趋于稳定。堆肥过程中微生物的群落演替也表明微生物群落的代谢功能发生变化，张超[47]在绿豆皮与玉米秸秆混合发酵的实验中通过Tax4Fun预测了细菌操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）的微生物功能，发现与糖类代谢相关的序列在堆肥的升温期丰度最高，与氨基酸代谢相关的序列在高温期有显著提升，并在堆肥后期保持稳定，该研究表明氨基酸可以在堆肥中产生，并在高温期被大量利用。

不同种类的秸秆堆肥的关键功能微生物群落同样具有差异性，张丽丽[48]通过整合宏组学技术对玉米和小麦堆肥过程中的关键功能微生物群落进行研究，发现在玉米秸秆堆肥中具有明显的群落演替情况，而在小麦秸秆堆肥中没有较明显的微生物群落演替变化，这是由于小麦秸秆的组分和结构差异造成的，并且未形成以纤维素降解微生物为主导的优势功能群落。黄丹莲[49]通过对水稻秸秆与蔬菜根茎混合堆肥的醌指纹图谱进行分析，发现初始堆肥中含9种醌，高温期为12种，进入降温期后，醌的种类增加至17种，说明该堆肥模式下的微生物群落演替主要发生在高温期至降温期阶段。上述试验均表明单一菌种很难在堆肥的各个时期都发挥出优异的降解功能，因此复合菌剂比单一菌种对加快堆肥腐熟的效果更为显著。

2.2 高效秸秆降解菌剂的研究进展

秸秆高温复合降解菌系的研究报道主要集中在玉米、小麦与水稻秸秆，而秸秆低温复合降解菌系的报道则主要集中在玉米秸秆，如表3所示。其体系构成主要分为三类，第一类是由具有秸秆降解能力的多种细菌构成。和真菌相比，细菌如Bacillus具有更快的生长速率及抗逆性（耐酸，耐碱，耐高温），因此更易于工业化应用[50]，并在维持堆肥体系的稳定以及加速腐熟方面发挥重要作用[51]；
第二类由多种细菌和真菌构成，目前大部分秸秆降解菌剂采用这一类，其在堆肥的各个发酵时期都具有良好的降解特性；
第三类是由具有秸秆降解功能的多种真菌构成，其优势在于木质素的微生物降解过程中真菌占主导地位[52]。秸秆的生物降解需要多种微生物及其分泌出的与降解有关的酶相互协同发挥作用，接种单一菌株很难对秸秆的快速降解产生作用[53]，这也是目前所有的秸秆降解菌剂中为何使用细菌与真菌结合的构建策略，因为真菌菌丝对木质纤维素结构的破坏能够帮助细菌定殖，而细菌对木质纤维素结构的改性则能够使真菌所产生的纤维素酶更加迅速的降解木质纤维素结构[54]。除上述三种体系外，目前有学者将秸秆原有的本土降解菌群与具有秸秆降解能力的功能菌进行组合，陈雪丽等[55]将秸秆降解菌群TF18与B.subtilis、胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）和B.amyloliticus组合，与玉米秸秆混合发酵8 d后，秸秆降解率达到21.3%。王一然等[56]对耐低温秸秆降解菌群JZ5进行简化，优化过的降解菌群对玉米秸秆降解潜力显著提高。唐玉等[57]从畜禽粪便和秸秆腐熟物中筛选到5类初始菌群并将这5类菌群相互组配，筛选出高效稳定的降解菌群GDS-10，液态发酵15 d后玉米秸秆的分解率为63.09%，表明该降解菌群对玉米秸秆有高效的降解能力。

表3 秸秆堆肥中复合菌剂的组成及应用效果Table 3 Composition and application effect of compound bacterial agents in straw composting

前人对秸秆发酵复合菌剂的研究较多，但大多只关注其对秸秆的降解能力，随着微生物技术的发展，一些学者在秸秆降解菌剂的基础上添加具有其他功能的微生物，使菌剂同时具有两种及两种以上的功能[57-59]。目前，关于此类复合菌剂的研究大多以双功能菌剂为主，其功能大致分为以下几类，第一具有促产特性的降解菌剂；
第二具有生防特性的降解菌剂；
第三具有环保特性的降解菌剂。马志远等[59]在秸秆降解复合菌系中添加生防菌构建复合菌系，分析该复合菌剂对秸秆腐熟进程及对番茄生长的影响。结果发现，喷洒复合菌剂的处理组较喷洒清水的对照组提前4 d完全腐熟；
秸秆还田时施加复合菌剂可以促进番茄生长，对番茄灰霉病的防治效果达到27.92%。袁洋等[60]构建出一种多功能复合型微生物菌剂，接种后可有效缩短堆肥发酵周期，菌肥还田后在番茄上增产显著，增产率为7%。杨艳铭[61]通过对筛选到的高效秸秆降解菌的抗病特性及促生特性进行研究，获得2株同时具备高效秸秆降解、抗病及促生功能的菌株，利用酶活互补关系将其构建为复合菌剂，水稻堆肥试验结果表明，接种菌剂提高了高温期持续时间，60 d后纤维素和半纤维素降解率分别为48.59%和38.53%，显著高于空白对照，有效的促进了堆肥腐熟进程。

然而有学者研究发现，复合菌剂中菌株组合的降解效果并非是简单的叠加效应[72]，秸秆降解菌的丰富度并非越多越好，菌株之间可能存在一定的拮抗作用或资源竞争，从而减弱了复合菌剂对秸秆的降解效果[73]，所以在构建复合菌剂时需考虑各菌株在不同时期以及对秸秆的不同成分的降解效果。

秸秆是没有被完全合理利用的宝贵资源，在我国华中地区，玉米及小麦秸秆资源产量巨大。通过堆肥的方式将秸秆肥料化可以使其快速腐熟还田养土，而秸秆降解菌剂的添加不仅可以加速秸秆腐熟的过程，还田后不同程度的增加土壤中的总氮、总磷、总钾和有机质的含量，同时土壤中微生物群落结构及活性也相应发生显著变化，为实现农业废弃物的无害化处理资源化利用提供了良好的条件。但目前市面上的大部分微生物菌剂功能较为单一，在堆肥成本增加的同时，其实际应用效果远低于化肥与农药的共施，秸秆肥料化尚不能得到广泛的应用。因此，高效且多效的微生物菌剂在秸秆肥料化方面具有良好的市场前景。

作为未来应用较多的高效多效秸秆降解菌剂，不仅需要满足使秸秆堆肥快速腐熟的前提，还需发挥出其余一些有益功能，如减缓堆体氮素流失、生物防治、减少有害气体排放和作物增产等；
充分做到加速腐熟、以菌治污、以菌治虫、以菌治菌，减少化学肥料、杀虫剂和杀菌剂的使用，可为农业生产的良性发展做出突出贡献。

秸秆堆肥过程是由具有秸秆降解能力的功能微生物主导的发酵过程。为满足高温堆肥技术标准以及缩短秸秆堆肥堆制周期，获取秸秆降解的功能微生物和构建高效秸秆降解菌剂成为关键因素。前者以筛选具有木质纤维素降解能力的微生物为手段，以降解酶合成机理和优化菌株产酶条件为主要研究方向，同时优化选择出具备生物安全性及工业生产条件的菌株，为秸秆降解菌剂的构建提供更多选择；
后者以构建多菌种协同作用的秸秆降解菌剂为手段，以菌株间相互关系和添加配比为主要研究方向，细化出各菌株发挥最佳作用的时间段，同时应注意菌株间的拮抗关系、适用地区及秸秆类型。整体看来，基于对秸秆降解功能微生物及高效秸秆降解菌剂研究的逐渐深入，必将促进我国秸秆肥料化技术的发展与应用。

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