改性玉米蛋白粉和肠膜蛋白粉组合替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能、饲料利用和免疫性能的影响

■ 陈 明 贠 彪 王 胜 解绶启 钱雪桥*

（1.广东海大集团股份有限公司，广东广州 511400；
2.中国科学院水生生物研究所，湖北武汉 430072）

鱼粉（FM）因其具有营养平衡、适口性好、易被水产动物消化吸收等优点而广泛应用于水产饲料。近年来，鱼粉的市场价格大幅上涨，限制了鱼粉在饲料中的使用[1-2]。因此，寻找优质的蛋白源来替代鱼粉已成为当下饲料行业的研究热点。

玉米蛋白粉（CGM）是一种玉米淀粉加工过程中的副产品，因其缺少抗营养因子，纤维含量低，故玉米谷蛋白粉具有取代鱼粉的潜力[3]。研究表明玉米蛋白粉可以替代鱼类饲料中30%～70%的鱼粉，在鱼粉含量为27%的饲料中用玉米蛋白粉替代10%的鱼粉对凡纳滨对虾生长没有影响[4]。改性玉米蛋白粉（MCGM）将玉米蛋白粉中的蛋白质通过多种酶复合技术进行改性处理，提高其水溶性能，增加酸溶蛋白和肽的比例，进而提高其消化吸收利用率。有研究表明混合蛋白源替代鱼粉比单一来源更好，因为混合蛋白源有更好的氨基酸组成，单一蛋白源替代鱼粉可能会造成饲料氨基酸不平衡，钙磷缺失，适口性差等问题，从而影响水产动物正常生长[5]。肠膜蛋白粉（DPS）是以提取肝素后的猪小肠及肠黏膜的水解产物为底物，再经一系列蛋白酶长时间酶解与特殊酶处理加工而成，含有丰富的诱食肽和小肠促生长肽，可促进水产动物摄食和提高肠道消化酶活力[6-8]。有研究证明，肠膜蛋白粉可以替代珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus ♂×Epinephelus lanceolatus ♀）饲料中9%的鱼粉，而对鱼体生长无显著影响[9]。目前还未见肠膜蛋白粉在凡纳滨对虾中的研究。

玉米蛋白粉和肠膜蛋白粉混合添加，可以保证氨基酸平衡，提高鱼粉的替代比例。本研究用改性玉米蛋白粉和肠膜蛋白粉混合成一种复合蛋白源替代饲料中的鱼粉，研究复合蛋白源对凡纳滨对虾生长，血液生化指标，抗氧化和免疫功能的影响，以期降低饲料成本，为复合蛋白源替代鱼粉提供一定的理论依据和参考。

1.1 试验设计及饲料配方

本试验以复合蛋白源分别等氮等脂替代0、20%、40%、60%、80%、100%的鱼粉制作了6 组配合饲料，分别命名为CD1（对照组，基础饲料）、CD2、CD3、CD4、CD5 组和CD6 组。饲料配方及营养水平见表1。将所有原料用搅拌机混合均匀后放入压条机（F-75型双螺旋杆挤条机，广州化工光电科技有限公司）压条，制成直径1.2 mm 的条状饲料后，再放入制粒机（G-500 型造粒机，广州化工光电科技有限公司）制粒。制粒后所有饲料置入熟化桶内熟化30 min。所有饲料在25 ℃阴干后过筛，按组别分装置于-20 ℃保存。

表1 试验饲料配方及营养水平（%）

1.2 生长试验

本试验所用凡纳滨对虾虾苗购买于珠海海兴农种苗厂，试验在海大集团莲溪试验基地进行。在生长试验正式开始前，使用相同的商业饲料暂养投喂20 d。暂养结束后，挑选初始重量约为（0.80±0.01） g健康有活力的试验虾，分为6 个试验组，每个试验组4 个重复，每个重复60 条虾，试验在室外土塘搭建的悬挂网箱试验系统中进行，该系统由24 个网箱(长100 cm×宽100 cm×高150 cm)组成。试验虾每日投喂三次(07：00、12：00 和18：00），餐后1.5 h 观察摄食情况，根据摄食情况调整投喂量并记录投喂量，养殖试验周期为56 d。试验前期试验虾较小，需要对饲料进行粉碎处理，将粉碎后的饲料通过16目和36目叠加的筛网，取此两粒径筛网之间的破碎料进行投喂，后期（试验虾大概5 g左右）逐渐转喂正常颗粒饲料。养殖期间，测定水中溶解氧含量为5.5～7.0 mg/L，氨氮含量为0～0.2 mg/L，水温保持在29～31 ℃，盐度4‰～7‰。及时记录投喂情况。

1.3 样品采集

生长试验期间每周进行一次称重记录试验虾生长情况。生长试验结束后，统计每个网箱试验虾存活尾数、总重以及投喂的饲料总重等，计算存活率、增重率、饲料效率等。取样前将试验虾饥饿24 h，每个实验组中随机取10 尾虾于-20 ℃保存，用于体组成分析，另取10尾虾用肝素钠浸润的1 mL针管头部取血，在4 ℃，3 000 r/min 下离心15 min，吸取上清液血清，-80 ℃保存备用，用于血清生化指标分析。另取5 尾虾测量其体重、体长和肝胰腺重量，用于计算肝体比，同时采集肝胰腺-80 ℃保存，用于生化指标分析。

1.4 生长指标计算

末均重（FBW，g）=末总重/末尾数

增重率（WG，%）=100×（末均重-初始均重）/初始均重

特定生长率（SGR，%/d）=100×[ln（终末体重）-ln（初始体重）]/养殖天数

肝体比（HSI，%）=100×肝胰腺重（g）/虾重（g）

肥满度（CF，g/cm3）=体重（g）/[体长（cm）]3

饲料效率（FE）=增重（g）/摄食量（g）

蛋白质效率（PER）=增重（g）/蛋白质投喂量（g）

蛋白质沉积率（PPV，%）=100×虾体蛋白质贮积量（g）/摄入的蛋白质总量（g）

1.5 样品测定与分析

用杜马斯燃烧法快速定氮仪（Elementar，德国）测定虾和肌肉的粗蛋白，用全自动脂肪仪（ANKOMx715自动脂肪仪，美国）测定虾和肌肉的粗脂肪含量。肌肉样品在烘箱中 105 °C 烘干3 h，全虾样品在烘箱中105 ℃烘干24 h，按照减重法计算水分含量。

用全自动生化分析仪（Hitachi 7170，日本）测定血清碱性磷酸酶（ALP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（CHO）和三酰甘油（TG）水平。

同时试验结束后，根据南京建成生物工程技术研究所有限公司检测试剂盒的操作说明，进行各组实验虾肝胰腺谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）含量的测定。

1.6 数据统计分析

试验所得数据采用SPSS®（SPSS， Inc.，美国）23.0，采用正交多项式对比法进行单因素方差分析（oneway ANOVA），结果以“平均值±标准误”表示，差异显著（P＜0.05）时用Duncan’s检验进行多重比较分析。

2.1 生长性能和饲料利用

如表2 所示，CD2 组试验虾WG 显著高于CD5 和CD6 组（P＜0.05）。与CD1 组相比，复合蛋白源替代20%、40%、60%以及80%鱼粉皆对凡纳滨对虾WG 和SGR 无显著影响（P＞0.05），而100%替代鱼粉则显著降低对虾的WG和SGR（P＜0.05）。CD5组和CD6组对虾FE 也显著低于其他各组（P＜0.05），而CD6 组的PPV也显著低于其他各组（P＜0.05）。

表2 复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能、体形态学和饲料利用的影响

2.2 体组成分析

如表3 所示，复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾全虾体组成皆无显著影响(P＜0.05)。

表3 复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾体组成的影响(%,湿重)

2.3 血清生化指标

如表4 所示，CD3 组ALP 显著高于CD1 组（P＜0.05），而CD6 组的ALP 显著低于其他各组（P＜0.05）。CD1 的AST 含量最低（P＜0.05），而CD6 组的AST 的含量最高（P＜0.05）。CD6 组试验虾血清ALT 和TG 含量显著高于其他各组（P＜0.05），而血清TP 含量较其它各组显著降低（P＜0.05）。

表4 复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾血清生化指标的影响

2.4 肝胰腺生化指标

如表5 所示，CD6 组试验虾肝胰腺GPX 和SOD 含量显著低于其他各组（P＜0.05），而其他各组间差异不显著（P＞0.05）。CD5 组肝胰腺LZM 活性显著低于CD4 组（P＜0.05）。CD5 组和CD6 组ACP 活性显著低于CD1 组和CD2 组（P＜0.05）。而CD6 组的MDA 含量显著高于除CD5组外的其他各组（P＜0.05）。

表5 复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺酶活的影响(U/mg prot)

3.1 生长性能，饲料利用和体组成

本研究中，由酶解肠膜蛋白粉和玉米蛋白粉组合蛋白源替代不超过80%的鱼粉不会显著影响凡纳滨对虾的生长性能，但复合蛋白全替代鱼粉后会造成凡纳滨对虾增重率显著降低。在凡纳滨对虾的研究中，玉米蛋白粉最多可替代10%的鱼粉而对其生长性能无显著影响[4]，而在日本对虾研究中，玉米蛋白粉替代鱼粉比例提高到了22%[10]。然而，复合蛋白替代鱼粉可以使鱼粉的替代比例大幅上升。含有玉米蛋白粉的复合植物蛋白源（双低菜粕∶大米蛋白粉∶玉米蛋白粉=5∶3∶2）可以替代配合饲料中80%的鱼粉而不会影响凡纳滨对虾的生长[11]。我们可以发现，除了品种的差异，玉米蛋白粉性状的改变也会影响替代鱼粉的比例，改性后的玉米蛋白粉消除了部分抗营养因子，胃蛋白消化率更高，更符合水生动物的营养需求[12]。李凤玉等[13]饲料中用发酵玉米蛋白粉替代42.8%鱼粉不会对斑节对虾的生长性能、免疫应答和肠道消化能力产生负面影响。有研究发现，用鸡肉粉、大豆浓缩蛋白和发酵豆粕组成的复合蛋白替代配合饲料中40%～80%的鱼粉对卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）的生长性能没有显著影响[14]，这与本文的研究结果相似。配合饲料中用复合蛋白替代一定比例的鱼粉不会对大口黑鲈（micropterus salmoides）[15]、加州鲈幼鱼[16]，三倍体虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[17]和大菱鲆（Scophthalmus maximus）[18]的生长造成显著影响。动植物复合蛋白相较于单一蛋白可以替代更多的鱼粉，过多的植物蛋白会造成饲料适口性下降，消化利用率低，从而导致替代鱼粉比例较低，单一动物蛋白存在氨基酸不平衡的问题[19]，而动植物复合蛋白可以调节氨基酸组成从而极大程度地提高复合蛋白替代鱼粉的水平。这是复合蛋白源可以替代80%的鱼粉的主要原因。鱼粉不能完全被复合蛋白替代，一方面是由于氨基酸组成与鱼粉有差异，另一方面可能是缺乏某些鱼粉特有的营养元素。

本研究发现，复合蛋白源全替代鱼粉时会显著降低FE、PER 和PPV。植心妍等[8]的研究发现用酶解肠膜蛋白替代36%的鱼粉会使FE 显著降低，大菱鲆配合饲料中用动植物蛋白替代70%以上鱼粉时，会使FE 大幅降低，都与本实验的研究结果近似[20]。全替代组实验虾PER 和PPV 下降的原因可能是复合蛋白源组成的蛋白质和氨基酸消化率低于鱼粉[21]。也可能是因为饲料中小肽和游离氨基酸的含量过高，机体肠道转运能力超负荷。此外，快速涌入机体的小肽可能会加速氨基酸氧化和内因性排泄,从而影响氨基酸的转运，最终抑制鱼体对蛋白质的吸收[22]。在本试验条件下，复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾体组成，HSI 和CF 无显著影响。这与动植物复合蛋白在海水鱼的研究上一致[23-24]。

3.2 血清生化指标

本试验中，复合蛋白源完全替代鱼粉会造成凡纳滨对虾血清AST，ALT，CHO 和TG 水平显著升高，同时，血清ALP 和TP 显著降低。血清总胆固醇和三酰甘油可以反馈动物脂质代谢情况[25]，CD6组血清AST、ALT 和TP 显著增加，有研究表明，当鱼粉含量降低后，会使肝胰腺负担增加，导致ALT 和AST 大量游离到血液[26]。CD6 组血清CHO 和TG 水平显著升高，这可能是由于当复合蛋白源替代水平升高后，饲料中不饱和脂肪酸减少，影响脂肪代谢酶造成的[27]。有研究发现，饲料中添加复合植物蛋白会上调肝胰腺中促炎因子的表达，复合蛋白源过量替代鱼粉对动物肝胰腺造成了一定胁迫，导致ALT 和AST 大量游离到血液，这可能是CD6 组试验虾AST 和ALT 显著上升的原因[28]。本试验结果表明，复合蛋白源替代鱼粉比例不宜高于60%，否则会对凡纳滨对虾健康产生负面影响。

3.3 肝胰腺生理生化指标

生物抗氧化酶系统主要包括：超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等，其主要作用是防御机体肝胰腺代谢异常产生ROS 对机体肝细胞产生的影响[29-30]。本试验中，复合蛋白源全替代鱼粉会造成凡纳滨对虾肝胰腺GPX、SOD和ACP活性显著降低，同时MDA 显著升高。CD5 组试验虾肝胰腺LZM 也有下降趋势。这与在虹鳟中观察到的现象一致[17]。玉米蛋白粉替代鱼粉过多，也会造成鲍鱼(Haliotis discus hannai)血清中SOD、LZM、ACP 和ALP活性下降[31]，这与本文观察到的现象一致，植物蛋白含量过多可能是造成凡纳滨对虾抗氧化和免疫功能减弱的原因。

综上所述，以生长性能和生理生化指标为评价指标，饲料中复合蛋白源能替代部分鱼粉而对凡纳滨对虾的生长性能没有显著影响。然而，复合蛋白源全替代鱼粉会降低凡纳滨对虾的生长性能，饲料利用率，免疫力和抗氧化能力。

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