tNGS,技术在基层医院感染早期精准诊断中的重要性

方 超

（江油市人民医院呼吸内科，四川 江油 621700）

感染性疾病的发病率、死亡率均较高，直接威胁了人类的健康。目前针对感染性疾病管理策略的关键为进行病原体检测，当前多种传统诊断技术可应用于病原学诊断中。靶向基因测序（tNGS）技术在临床病原学应用中，通过进行中枢神经系统感染、肺部感染的病原体检测，为常见致病菌的诊断提供了一定可能。tNGS 是主要基于高通量测序（NGS）的靶向富集测序技术，tNGS 作为一种关键技术，主要通过对目标基因组区域（ROI）进行富集，来确保ROI 区域足够的深度、覆盖度，并进行目标病原体的识别。传统方法整体检测通量有限，通过对tNGS 技术进行应用，整体效果较好。

选取宏基因组下一代测序（mNGS） 检测的肺泡灌洗液标本的检测结果，做好实验室检测结果、临床症状以及影像学检查结果分析，并做好病理结果以及治疗结果的对比分析。选取40 例惠普尔养障体阳性样本，做好分析。11 例患者进行手术治疗，2 例患者进行经支气管镜肺组织活检术（TBLB），3 例患者进行经皮肺穿刺活检术。

11 例患者进行了手术治疗，2 例患者进行了TBLB，3 例患者进行了经皮肺穿刺活检术。10 例患者的组织病理学诊断结果为肿瘤；
2 例患者的组织病理可见多核巨细胞，考虑为结核的可能性大；
1 例患者的组织病理学行PAS及六胺银染色呈阳性，考虑为隐球菌感染。根据组织病理学检查结果，所有患者均未出现医院死亡。

基层医院是守护人们健康的第一道防线，承担着许多重要的医疗任务。然而，由于基层医院医疗资源有限、医疗水平参差不齐，所以基层医院感染的诊断和治疗面临着一定挑战。感染性疾病的早期诊断对于及时采取有效治疗至关重要，但传统的感染诊断方法在准确性和灵敏度上存在局限性，容易导致漏诊或误诊。基层医院医疗水平和设备设施相对落后，缺乏先进的诊断技术支持，限制了感染诊断的精准性和及时性。同时,由于基层医院医护人员的专业水平参差不齐，感染诊断能力高低不平，加大了诊断难度。另外，传统的病原学检测方法往往需要较长的时间才能得出结果，这在感染的早期诊断中显得尤为不足。因此，迫切需要一种快速、准确、高通量的诊断技术来帮助基层医院提高感染早期诊断的准确性和效率。tNGS 技术的出现为这一问题提供了解决方案，其具有对多种病原体同时检测、快速诊断、高灵敏度和高特异性的优点，可帮助基层医院及时鉴别感染病原体，指导临床治疗，降低感染对患者的危害。

tNGS 靶向富集策略中，杂交捕获靶向测序利用探针富集目标片段，在进行液相杂交捕获测序、碱基互补配对的同时，对DNA 文库进行杂交富集，从而进行测序[1]。杂交捕获测序一般是针对目标病原体、探针和精细化数据库的构建。在建立多重PCR 引物进行扩增的同时获得测序技术。一般适用于检测几十、几千个位点，整体适用研究目标区域较小。对于较低模板的DNA，一般能够产生足够数量的扩增子，在明显提升效率、节约时间的同时降低成本[2]。

tNGS 的技术优势：第一，富集增加目标微生物检测覆盖，能够提升可信度。tNGS 通过靶向富集目标序列，能够提升对于微生物检测的比例。tNGS 的靶向富集，在不去除宿主、提升检测可信度的条件下，能够提升微生物的对应序列数。第二，tNGS 能够提升耐药以及毒力基因检测，可鉴别病原感染样本中是否存在耐药型别。目前主要难点为将耐药基因、致病病原相结合，对于耐药基因的复杂性需要进行致病菌的解读。通过研究结核菌耐药性基因改变的情况，可以得到精确的突变位点。tNGS 针对耐药、毒力基因进行区域富集，以此来确保稳定地检出。第三，tNGS检测因目标病原体范围较为明确，在简化解读流程的同时，还能使tNGS 数据库聚焦多种病原体，并进行不同亚型的区分。tNGS 检测作为依据已知病原设计的检测，目前来说，其效果良好。

单核细胞增生李斯特氏菌作为革兰阳性菌、兼性厌氧细菌，是常见的食源性致病菌。该病菌被摄入后会导致人、畜感染。单核细胞增生李斯特氏菌感染主要是受细菌菌株、宿主等免疫状态的影响。尽管此种细菌引起的感染较为罕见，但感染后的症状比较严重。通过抗生素的应用，依照标准程序收集脑脊液，随后进行储存。研究表明，急性/亚急性脑膜炎在经磁共振、血培养提示中，脑脊液一般为阴性。通过对脑脊液进行鉴定、测序，其符合李斯特菌的读数，同时成像双相病程[3]。单核细胞增生李斯特氏菌感染的前驱症状主要表现为头痛、恶心以及呕吐，随后可发展成为神经系统症状，严重时会出现呼吸衰竭，因此进行适当诊断、抗生素治疗尤为重要。有研究通过明确中枢神经系统感染的致病微生物，使用生化、细胞学以及革兰染色等检测方法，在测序平台进行测序的同时，扩增后使用基因分析仪进行测序分析，采用tNGS 共检测到核酸序列数为57-2611 条，平均为60.21%。tNGS 在李斯特菌检测中具有一定优势，同时能够识别出细菌病原体。当前遗传性原发性免疫缺陷患者死亡的主要原因为病毒性肝炎，使用tNGS 进行深度测序分析，在获得完整基因组的同时，显示出高水平同源性，具有病原谱范围明确、检测精度高的优势。目前tNGS 在疾病诊断中可用性不断增加[4]。tNGS 技术的应用，可有效缩短诊断时间，提高病原菌的检出率。通过对患者脑脊液样本进行tNGS 检测，可以在较短时间内获得大量的DNA 序列信息，实现对病原体种类和数量的全面分析。与传统方法相比，tNGS 技术不受病原体培养的限制，可以检测到一些难以培养或未知的真菌种类，为医生提供更全面的诊断依据。

受到人员、环境、患者等多重因素的影响，重症监护室（ICU）是极易出现感染的场所之一，如在对患者进行操作时，操作不规范；
未严格按照规范进行无菌操作；
患者病情相对危重，侵入性伤口较多；
患者在转入重症监护室时已伴有明显的肺部感染。相关研究发现，感染作为影响重症病房患者预后的危险因素，出现率相对较高，在延长患者住院时间的同时，还会导致患者的生存质量、生命安全受到影响。ICU 集中了不同病种、不同程度的感染，感染菌株常为多重耐药菌株，是引起多系统器官衰竭及导致死亡的重要因素，因此在治疗过程中，减少不良事件发生的同时，提高感染早期诊断的准确性和效率同样重要。

面对频发的新发传染性疾病，以及逐年上升的微生物耐药率等问题，快速、精准的病原诊断及其耐药性评估尤为重要。tNGS 技术兼顾PCR 技术的灵敏性、时效性、特异性以及NGS 技术高通量的特点，实现了一次检测仅需12 小时，可同时检测数十种至数百种的病原及其相关的耐药基因和毒力基因。此外，它还可以实现DNA和RNA 共检测，且病原可细分至亚种或亚型，能够快速、客观地检测临床标本中不同类型的病原微生物，为病原学诊断提供了新的临床选择。

2021 年初，金域医学联合开发的tNGS 检测项目正式为临床提供检测服务。同时，作为tNGS 病原检测技术的领航者，金域医学与金圻睿生物科技有限责任公司针对不同感染症候群、不同标本类型开发了多种检测产品，并为满足不同地区的检测时效性，在国内19 个省市区实现了本地化检测，搭建起全国规模较大的tNGS 感染检测中心。2022 年10 月，为保证多重呼吸道病原体核酸检测结果的准确性，使其得到更好应用，上海市临床检验中心开展多重呼吸道病原体核酸检测室间质评活动，金域医学基于tNGS 技术平台开发的“呼吸道病原体靶向检测153 项”和“呼吸道病原体靶向检测95 项”检测项目被纳入其中。2023 年初，上海市临床检验中心公布的2022 年调查计划《多重呼吸道病原体核酸检测》总体样本结果，金域医学（603882）满分通过。这是国内室间质评活动首次对tNGS 病原体检测项目进行质量评价，证实加强病原体检测技术的研究和应用，对于感染性疾病的临床诊治具有重要的指导意义。

作为现阶段常见的呼吸系统感染性疾病，肺部感染发病率较高，如果治疗不及时将会出现呼吸衰竭，整体预后较差。在肺部感染的诊断中，细菌是常见的致病因子之一。传统的细菌检测方法需要较长的时间和较复杂的操作流程，限制了在基层医院进行快速和准确的诊断，而利用tNGS 技术可以在较短的时间内对样本中的细菌进行高通量、高灵敏度的检测。tNGS 技术可以检测到包括少量细菌在内的所有细菌种类，大大提高了感染早期诊断的准确性和敏感性。在真菌检出方面，tNGS 技术能够帮助医生更快速、更准确地确定感染的真菌种类，为合理的抗真菌治疗提供重要依据。传统的真菌检出方法往往需要培养和鉴定，耗时且有一定限制，而tNGS 技术可以在较短时间内获得更全面的真菌信息，有助于及时有效地制定个体化的治疗方案。基于这些优势，tNGS技术在肺部感染细菌检出中的应用前景十分广阔，有望成为基层医院感染诊断的重要工具。有研究报告指出，侵袭性肺曲霉菌病（IPA）的感染性强、病死率高，诊断较为困难，患者进行常规抗感染治疗效果不佳。在对患者进行支气管灌洗的同时，使用tNGS 对支气管肺泡灌洗液标本进行测试，在收到样品后，tNGS 能够检测到烟曲霉的序列度数。研究中3 例患者给予伏立康唑抗真菌进行治疗，经胸部CT 进行复查，病灶吸收明显。IPA 目前发于血液系统恶性肿瘤患者，同时也是致命的真菌感染。因此早期进行肺曲霉菌的诊断具有一定的价值。tNGS 作为诊断免疫缺陷、功能受损的前景方法，pendleton 等通过使用基因组学进行呼吸道病原体的检测，报告显示对于相关间质性肺炎的患者，使用宏基因组测序能够进行金黄色葡萄球菌的快速检测。tNGS 在诊断肺炎病原体方面效果显著[5]。

结核分枝杆菌作为肺部感染病原体的一个重要部分，结核病是肺部感染病原体授予的重要部分。肺结核是一种严重的传染病，早期诊断和治疗对于患者的生存和康复至关重要。传统的结核菌培养和PCR 技术存在诊断时间长、假阳性率高等问题，而tNGS 技术可以同时检测出多种病原体，提高了对结核感染的检出率和准确性。因此，基层医院在感染早期诊断中应用tNGS 技术，有助于及时发现结核感染，采取有效的治疗措施，减少感染的传播和疾病的恶化。一项回顾性研究表明，心脏手术期间暴露在污染加热器冷却装置中的患者易受分枝杆菌嵌合体（M.chimaera）的感染，抗酸杆菌培养的诊断金标准通常需要侵入性取样。研究人员使用NGS 方法检测了10 名接受心脏手术患者的血浆，对标本进行抗酸杆菌培养[6]。接受血浆NGS 检测的10 名患者中，9 人患有侵袭性疾病，检查所需中位时间为4 d。在这些患者中，7 人首次获得了M.chimaera 感染的病原学确认。抗酸杆菌培养呈阳性所需中位时间为20 d，确认M.chimaera 的中位时间为41 d，在该序列获得的24 种抗酸杆菌血培养物中，只有4 种（17%）呈阳性。在这些患者中，90%接受了侵入性手术，只有5 名患者（50%）表现出分枝杆菌的增长。潜伏期和非特异性症状使感染M.chimaera的患者无法被轻易识别。因此，等离子NGS 可以比抗酸杆菌培养物更快，更准确地检测奇异菌，这是一种有价值的新型诊断工具。同时，结核病耐药性是世界上最大的健康问题之一[7]。遗传敏感结核菌株和耐药菌株分析表明，tNGS 通过估计的积极和消极预测值，检测出了菌株抗性。研究人员从哈利姆大学医学中心的临床样品中收集了36 株结核菌株，通过核酸提取、PCR 和基因测序、生物特征分析、估计预测值和统计分析得出结果，与耐药性相关的突变有24 个，其中基因型和表型对二丙酰胺、利福平、乙胺丁醇一贯敏感，对链霉素和氨基霉素的反应较差。

综上，tNGS 在临床检验中越来越受关注，正被广泛应用于呼吸系统感染、血流感染等临床检验领域。早期进行tNGS 检测，能够有效提升诊断准确性，整体效果良好。

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