基于网络药理学和分子对接技术分析柴胡-白芍药对治疗肝损伤的作用机制

陶纯立 冯春艳

肝损伤（liver injury, LI）是一种由于酒精刺激、病毒性肝炎、药物性肝炎、化学污染等导致肝脏细胞凋亡、坏死和纤维化损伤的疾病[1]。LI是多种肝病的起始阶段，随着病情进展严重者则会发生肝脏纤维化、肝硬化、肝衰竭等[2-3]。因此，阻止LI的发生和发展具有重要意义。

中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，在疾病的治疗中具有独特优势。柴胡-白芍作为中医疏肝气常用药对，在临床中常用于治疗肝脏损伤性疾病[4]。柴胡为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根，具有和解表里，疏肝升阳之功效[5]。白芍本品为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有养血柔肝之功效[6]。有研究报道，柴胡-白芍配伍后可减轻肝脏炎症反应，提高细胞色素CYP2E1酶活性，减轻氧化应激反应，发挥治疗LI作用[7-9]。

网络药理学可用于创建基于靶分子、生物学功能和生物活性化合物的复杂作用网络，系统地反映中医药多成分、多靶点、多途径的疾病干预机制[10]。本研究基于网络药理学和分子对接技术，筛选出柴胡-白芍药对的活性成分，以及治疗LI的作用靶点和信号通路，以探究柴胡-白芍药对抗LI的作用机制，为柴胡-白芍药对治疗LI的进一步研究，以及中医药治疗LI提供理论依据。

1.1 柴胡-白芍药对活性成分及靶点筛选

运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥0.30且类药性（drug-likeness, DL）≥0.18为条件筛选得到柴胡-白芍药对的活性成分化合物及对应靶点，运用Pubchem平台（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取靶点Canonical SMILES号，通过SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）及TargetNet数据库（http://targetnet.scbdd.com/）预测并获取有效靶点。

1.2 疾病靶点筛选

运用GeneCards（https://www.genecards.org/）及OMIM数据库（https://www.omim.org/）以“liver injury”为关键词，筛选获取LI疾病基因靶点，以相关性分数＞4为标准，去除重复基因，整理导入Excle表。运用Venn 2.1平台，将柴胡-白芍药对靶点与LI疾病基因靶点进行分析取交集，得到韦恩图，即柴胡-白芍药对治疗LI的潜在靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络构建

将柴胡-白芍药对抗LI的潜在靶点导入String数据库（https://cn.string-db.org/），靶点网络以PPI阈值0.9为标准，隐藏游离靶点，获取PPI网络，下载PPI可视化图和潜在靶点.TSV文件。将潜在靶点.TSV文件使用Cytoscape 3.9软件打开，进行Network analyze分析，根据Degree值，绘制可视化PPI图。

1.4 “药物-活性成分-靶点”网络

将柴胡-白芍药对治疗LI的活性成分和潜在靶点进行整理，运用Excel建立“药物-活性成分-靶点”表，导入Cytoscape 3.9软件构建关系网络，并进行可视化处理。

1.5 基因本体（gene ontology, GO）功能及京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

运用DAVID数据库将柴胡-白芍药对治疗LI的作用靶点进行GO功能及KEGG富集分析，获取数据，选择GO功能分析前10的结果和KEGG富集分析前20的结果，运用微生信数据可视化平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化处理。

1.6 分子对接

将活性成分和潜在靶点进行分子对接，使用PDB数据库（https://www1.rcsb.org/）获取受体蛋白的结构文件。使用PyMOL 2.3.0软件对下载的受体蛋白进行删除水分子和原配体等操作。使用PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载Inositol小分子结构文件并使用Chem3D软件对配体分子进行计算，得到能量最小化的配体分子最优结构。使用Auto Dock Vina v.1.2.0软件将靶点蛋白和小分子进行分子模拟对接，得到对接结合能以及对接结果文件。结合能越高，结合构象越稳定，受体与配体之间结合的可能性越大。

2.1 柴胡-白芍药对活性成分及靶点

共筛选得到柴胡-白芍药对的活性成分27个，包含1个共有活性成分，为山柰酚（Kaempferol），见图1。通过SwissTargetPrediction及TargetNet数据库预测并获取有效靶点，去除重复后，得到480个药物靶基因。

图1 柴胡-白芍药对的活性成分

2.2 柴胡-白芍药对治疗LI的作用靶点

通过GeneCards及OMIM数据库获取LI疾病基因靶点，得到疾病靶点2 692个。将2 692个疾病靶点与柴胡-白芍药对480个药物靶点在Venn 2.1中生成韦恩图，映射出216个共有靶点，即柴胡-白芍药对治疗LI的作用靶点。见图2。

图2 柴胡-白芍药对抗LI的潜在靶点韦恩图

2.3 PPI网络

将柴胡-白芍药对治疗LI的潜在靶点导入String数据库，获得PPI网络，包括239条边，216个节点。将String数据库下载的潜在靶点.TSV文件使用Cytoscape 3.9软件打开，进行Network analyze分析，根据Degree值，选取排名前30的靶点绘制可视化PPI图，其中靶点Degree值越大，则节点越大，颜色越深。排名前5的靶点分别为蛋白激酶B1（AKT1）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）。见图3。

图3 PPI网络

2.4 “药物-活性成分-靶点”网络

将柴胡-白芍药对、活性成分、交集靶点建立“药物-活性成分-靶点”Excel表，导入Cytoscape 3.9软件构建关系网络，获得“药物-活性成分-靶点”网络。其中红色V字形代表药物，紫色圆形代表活性成分，绿色方形代表靶点。见图4。

图4 “药物-活性成分-靶点”网络

2.5 GO功能分析

DAVID数据库将柴胡-白芍药对治疗LI的作用靶点进行GO功能分析，富集结果按照P值排序，将前10条结果在微生信数据可视化平台进行可视化。其中，生物过程（biological process, BP），包括对细菌来源的反应、对脂多糖的反应、药物反应、节律反应、肽基酪氨酸修饰等。细胞组分（cellular components, CC），包括细胞膜、膜筏、膜微区、质膜、质膜凹腔等。分子功能（molecular function, MF），包括核受体活性、配体活化转录因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血红素结合、药物结合等。见图5。

图5 GO功能分析

2.6 KEGG富集分析

分析柴胡-白芍药对治疗LI的KEGG富集分析，结果按照P值排序，将前20条结果在微生信数据可视化平台进行可视化。通过分析气泡图结果并结合LI相关通路可知，柴胡-白芍药对治疗LI的信号通路主要有PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路等，见图6。

图6 KEGG富集分析

2.7 分子对接

根据PPI分析结果，运用Auto Dock Vina v.1.2.0软件将度值排名前5的核心作用靶点AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR与柴胡-白芍药对的7个核心活性成分进行分子对接，获得蛋白结合能热图。结果显示，柴胡-白芍药对中活性成分与关键靶点均对接稳定，其中β-谷甾醇与TNF结合能力最强，结合能为-11.4 kcal/mol；
山柰酚与TNF结合能力较强，结合能为-10.2 kcal/mol，见图7。将结合能最强的以上两个结果用PyMOL和Discovery Studio 2019进行可视化作图。见图8～9。

图7 活性成分与核心靶点的对接结合能

图8 山柰酚与TNF对接

图9 β-谷甾醇与TNF对接

肝脏作为重要的代谢和解毒器官，尤其是受到炎症、酒精、病毒、药物、化学污染等刺激，肝脏对有害化学物质解毒的能力将超负荷，易导致肝脏细胞及功能损伤[11]。研究发现，LI作为急重症肝病的前驱阶段，是临床上危重病症的第五大常见诱因，因此，及时阻止LI的发生与发展具有重要意义[12]。LI在中医认为其病位在肝，多因肝气郁结、肝络失养所致。叶天士《临证指南》提到“七情之郁居多，并大都是悒郁伤肝”，《素问·六元正纪大论》提到“郁之甚者，治之奈何？木郁达之……然调其气”，在治疗上多用疏肝理气，解郁和络之法。故临床常用柴胡、白芍等疏肝类中药治疗。

本研究基于网络药理学探讨柴胡-白芍药对治疗LI的作用靶点及信号通路，研究其潜在机制，筛选得到柴胡-白芍药对活性成分27个，包括山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、槲皮素等；
PPI分析得到柴胡-白芍药对治疗LI的核心靶点216个，其中排名前5的靶点分为AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR。其中Akt是治疗LI的高频分子，AKT1作为Akt的同源基因，与LI关系密切[13]。研究发现，调节Akt蛋白能够改善肝细胞损伤[14]。TNF、IL6作为炎症因子，在LI的发生和发展中发挥重要作用，当肝脏受到炎症因子刺激，可导致肝细胞受损，招募肝脏中NK等巨噬细胞来分泌炎症因子，以起到调节免疫功能作用。而炎症因子过量分泌会加重LI，从而产生一系列联级反应[15-16]。大量研究表明，抑制TNF、IL6能够有效改善LI情况[17-18]。VEGFA、EGFR与细胞的增殖、血管生成、炎症及细胞凋亡的抑制有关[19-20]，研究表明，调节VEGFA、EGFR能够有效改善肝脏纤维化损伤[21-23]。

GO功能分析结果显示，BP涉及对细菌来源的反应、对脂多糖的反应、药物反应、节律反应、肽基酪氨酸修饰等，CC涉及细胞膜、膜筏、膜微区、质膜、质膜凹腔等，MF涉及核受体活性、配体活化转录因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血红素结合、药物结合等。KEGG富集分析结果显示，柴胡-白芍药对治疗LI主要涉及PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路等。其中，磷脂酰肌醇激酶PI3K激活，通过质膜的第二信与细胞内含有PH结构域的Akt结合，发挥改变细胞膜构象作用[24]。MAPK信号通路是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递通路，调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程[25]。研究表明，通过下调PI3K/AKT信号通路与MAPK信号通路，能够减轻肝脏炎症反应，起到防治LI的作用[26-28]。

运用分子对接技术，将柴胡-白芍药对活性成分与治疗LI的核心靶点AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR进行对接，发现分子对接结合构象稳定。其中山柰酚、β-谷甾醇与TNF结合能力最强，结合能分别为-11.4 kcal/mol、-10.2 kcal/mol。研究发现，山柰酚能用于多种LI类疾病的防治，通过调节PI3K/AKT信号通路，下调炎症因子TNF、白细胞介素的表达水平来防治LI[29-30]。β-谷甾醇能够通过下调炎症因子TNF的表达，改善肝功能水平来减轻肝纤维化损伤[31-33]。以上提示山柰酚、β-谷甾醇等成分与AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR核心靶点，可能为柴胡-白芍药对治疗LI的关键成分和靶点。

综上所述，本研究基于网络药理学、分子对接技术证明了柴胡-白芍药对能够通过多通路、多靶点治疗LI，其机制可能通过作用于AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR等核心靶点，调控PI3K/AKT、MAPK等信号通路有关。柴胡-白芍药对治疗LI的机制复杂，本研究缺少一定的体内外实验验证以进一步确定网络药理分析结果的准确性。后期将运用体内外实验来进一步探究柴胡-白芍治疗LI的机制，以期为中医药临床应用提供理论依据和新的方向。

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