孤立性心房颤动致病基因TBX20新突变的发现及功能研究

张道良 李宁 姜伟峰 吴绍辉 仇兴标 杨奕清

心房颤动（房颤）在一般人群中的发病率高达2%，可诱发智力下降甚至痴呆、血栓栓塞性脑卒中、急性肾损伤或慢性肾病、急性心肌梗死、心力衰竭、室性心律失常等并发症，甚至心源性死亡[1]。临床遗传研究表明，遗传缺陷是部分房颤的重要分子病因[2]。目前，除了已发现的140多个房颤相关遗传位点外，还发现60多个房颤相关基因，包括编码心脏离子通道、缝隙连接通道、心脏结构蛋白和转录因子蛋白的基因[1-2]。近年来研究发现，心脏转录因子TBX20可以转录激活调节多个房颤致病基因的表达，包括GJA5、NPPA、GJC1和KCNH2基因等[1-2]。本研究将TBX20基因作为房颤的候选致病基因进行研究。

1.1 研究对象

选取2015年3月至2017年12月就诊于上海交通大学医学院附属胸科医院的182例汉族孤立性房颤患者作为病例组，其中男性102例，女性80例，年龄32～56岁，平均年龄（53±6）岁。选取236名汉族无房颤健康体检者作为对照组，其中男性131名，女性105名，年龄35～57岁，平均年龄（53±7）岁。2组入选者均经过个人史及家族史回顾、仔细体检、标准心电图检查和心脏超声检查。孤立性房颤的诊断根据国际通用的房颤患者管理指南[3]。病例组中35例（约19%）有房颤家族史，对照组中均无房颤家族史。2组入选对象均无明确的可诱发房颤的环境因素。本研究遵守医学伦理学规范，并经过上海交通大学医学院附属胸科医院伦理委员会的核准。经研究对象知情同意后，收集其临床信息和外周静脉血标本，常规纯化、-20℃冰箱保存其基因组DNA。

1.2 方法

1.2.1 人TBX20基因的体外扩增 使用聚合酶链反应（PCR）仪（美国Bio-Rad公司）扩增人TBX20基因的编码区和剪接位点序列，引物序列见参考文献[4]。以每个入选对象的基因组DNA作模板，应用AccuPrimeTMTaq高保真DNA聚合酶试剂盒（美国Invitrogen公司）及化学合成的上述人TBX20基因的扩增引物，在PCR仪（美国Bio-Rad公司）上对人TBX20基因各片段进行体外扩增。PCR混合液的总体积为50 μL，其中包括10×AccuPrimeTMPCR BufferⅡ（内含dGTP、dATP、dTTP和dCTP各2 mmol/L）5.0 μL、正、反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL、AccuPrimeTMTaq 高保真 DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、基因组DNA（40 μg/L）2.0 μL、高压灭菌蒸馏水40.8 μL。PCR的温度循环条件设置为：94 ℃预变性20 s，随即进入温度循环36次，每次包括94 ℃变性20 s、62 ℃退火30 s和68 ℃ 延伸1 min，终末68 ℃延伸8 min。PCR产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳（80V、45 min）分离后，切胶回收并用GeneJET凝胶DNA回收试剂盒（美国Thermo Scientific公司）进行纯化。

1.2.2 人TBX20基因的PCR测序分析 以上述纯化的PCR产物为模板，使用1条人TBX20基因扩增引物（正向或反向）和 BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒（美国Applied Biosystems 公司）在PCR仪（美国Bio-Rad公司）上进行测序PCR。测序PCR混合液的体积定为20 μL，其中预混合液 Premix 8.0 μL、正向或反向引物（2 μmol/L）2.0 μL、人TBX20基因片段DNA（30 μg/L）2.0 μL、高压灭菌蒸馏水8.0 μL。测序PCR的条件如文献[5]所述：共30次循环，每1次循环包括95 ℃变性（20 s）、50 ℃退火（15 s）及60 ℃延伸（l min）。测序PCR产物使用BigDye XTerminator 纯化试剂盒（美国Applied Biosystems 公司）进行纯化。纯化后的测序PCR产物在遗传分析仪（美国Applied Biosystems公司）上进行凝胶电泳测序。将测出的人TBX20基因序列与核苷酸数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide）中的人TBX20基因序列（登陆号：NM_001077653.2）进行比对分析以发现人TBX20基因突变。如识别出人TBX20基因突变，则PCR测序分析236名对照者的TBX20基因，并且在线检索单核苷酸多态性（SNP）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）和gnomAD数据库（http://gnomad-sg.org/）以明确所发现的人TBX20基因突变的新颖性。

1.2.3 构建人TBX20基因的真核细胞表达质粒 野生型人TBX20基因的真核细胞表达质粒TBX20-pcDNA3.1的构建见参考文献[4]。以野生型人TBX20基因的真核细胞表达质粒TBX20-pcDNA3.1作模板，应用定位诱变试剂盒（美国Invitrogen公司）和1对互补引物（长度为31个碱基、突变点在中心），通过PCR生成Lys236*-突变型TBX20-pcDNA3.1。用DNA酶DpnⅠ（美国Thermo Fisher Scientific公司）切除野生型TBX20-pcDNA3.1模板，并通过测序证实获得Lys236*-突变型TBX20-pcDNA3.1。人KCNH2基因启动子驱动萤火虫荧光素酶表达的KCNH2-luc质粒的构建见参考文献[1]。

1.2.4 人TBX20基因突变体的功能研究 将HeLa细胞接种于24孔细胞培养板，置于细胞培养箱常规培养。借助Lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司）将多种表达质粒共转染入HeLa细胞，转染方法见参考文献[1]。每次转染实验用100 ng的空pcDNA3.1质粒（–）或100 ng的野生型人TBX20-pcDNA3.1表达质粒（WT）或100 ng的Lys236*-突变型人TBX20表达质粒（Lys236*）或50 ng的空质粒+50 ng 的WT或50 ng的空质粒+50 ng的Lys236*，同时共转染1.0 μg的人KCNH2-luc和40 ng的pRL-TK 质粒（美国Promega公司）。使用内对照海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK平衡每次转染的效率。HeLa细胞转染质粒后48 h进行收集并裂解。借助荧光定量分析仪（瑞士Tecan 公司），应用双荧光素酶（双报告基因）分析试剂盒（美国Promega 公司）分析HeLa细胞裂解液中2种荧光素酶的活性，以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值表示靶基因KCNH2启动子的转录活性。

1.3 统计学分析

连续变量参数如研究对象的年龄、靶基因人KCNH2启动子的转录活性等以均数±标准差表示；
分类变量参数如研究对象的性别、种族等用数字或百分比表示。2组连续变量参数的比较用Student’st检验（非配对）；
2组分类参数的比较用Fisher’s精确检验。双侧检验值P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.1 发现人TBX20基因新突变

本研究通过对182例孤立性房颤患者的TBX20基因进行测序分析，在1例51岁的男性散发性孤立性房颤患者中发现了1个TBX20基因杂合无义突变，即NM_001077653.2:c.706A＞T;p.（Lys236*）突变。该TBX20基因突变在其他181例孤立性房颤患者和236名无房颤对照者中均未检测出，在SNP或gnomAD数据库中也尚未报道，表明该TBX20基因突变是新发现的突变。该例散发性孤立性房颤患者的TBX20基因c.706A＞T杂合突变和1名无房颤对照者的纯合野生型对照DNA序列见图1。

图1 人TBX20基因c.706A＞T杂合突变及纯合野生型对照DNA序列

2.2 Lys236*-突变型人TBX20对靶基因KCNH2的转录激活作用丧失

在转染了多种基因表达质粒的HeLa细胞中，100 ng的TBX20和等量（100 ng）的Lys236*对人靶基因KCNH2启动子的转录激活效应分别约为36倍（36.13±2.20）和2倍（2.29±0.67），2组之间的转录激活效应差异有统计学意义（t＝25.48，P＜0.01）；
而在同时转染50 ng的TBX20和等量（50 ng）的Lys236*时，所产生的转录激活效应约为18倍（17.71±1.91），显著低于100 ng的TBX20对人靶基因KCNH2启动子的转录激活效应，2组之间差异有统计学意义（t＝10.94，P＜0.01）。

本研究在1例男性散发性孤立性房颤患者中发现了1种新的TBX20基因杂合无义突变，即NM_001077653.2:c.706A＞T;p.（Lys236*）突变。该TBX20基因突变在236名无房颤对照者中未检测出，在SNP或gnomAD数据库中也尚未报道。基于双报告基因定量分析表明Lys236*-突变型TBX20对靶基因KCNH2启动子的转录激活作用丧失，而KCNH2基因变异已被证实可导致多种类型的心律失常，包括房颤、短QT综合征和长QT综合征[6-10]。因此，TBX20基因突变极有可能是该例孤立性房颤患者的分子病因。

人TBX20基因定位于7号染色体7p15-7p14区域，编码1种由447个氨基酸组成的含有T-box的转录因子，属于T-box家族的5号成员[1]。研究发现，TBX20大量表达于胚胎发育期的心脏，且在出生后及成年人的心脏中持续大量表达，对心血管正常发育和适应性重构具有关键调控作用[11]。实验证实，TBX20可以单独调节或与其转录合作伙伴如TBX5、NKX2.5、GATA5或GATA4一起协同调节具有重要作用的心血管相关靶基因如GJA5、NPPA、GJC1和KCNH2的表达，从而影响心血管发育和重构[1,12-14]。此外，已发现GJA5、NPPA、GJC1、KCNH2、TBX5、NKX2.5、GATA5和GATA4基因突变均可诱发房颤[1]。本研究在孤立性房颤患者中发现的TBX20基因功能丧失性突变，表明人TBX20基因单倍型不足是房颤发生的分子病理机制之一。

TBX20基因功能障碍诱发房颤可部分归因于心脏结构和电生理异常。既往研究证实，TBX20基因在胎心发育、内稳态、成年心脏功能和病理生理适应，以及心脏电生理尤其是心脏传导系统功能等方面具有重要作用[11]。心脏传导系统发育不良或稳态失衡可致传导系统功能障碍，从而触发心律失常甚至猝死[1,11,15]。在成年小鼠，特异性敲除心肌Tbx20基因可导致心脏扩大、收缩功能丧失、心脏传导速度降低和严重心律失常[16-17]。此外，已有研究表明TBX20可以选择性地调节KCNH2基因的表达[1,12]。KCNH2基因编码Kv 11.1（hERG），形成快速激活延迟整流K＋通道α亚单位（辅助性β亚单位为KCNE2基因编码），而快速激活延迟整流K＋通道所产生的心肌动作电位3期复极电流是心肌复极的主要电流之一[17]。Caballero等[12]发现，TBX20基因功能丧失可降低hERG的表达，减少心肌内向整流K＋电流，导致心肌动作电位时程延长。经典心脏电生理理论认为，触发和折返是房颤的主要电生理机制，而触发活动可由心肌动作电位时程延长所致的早期后除极所引发[18]，因此，TBX20基因功能障碍诱发房颤可能主要与触发活动增加有关。

值得注意的是，既往有报道TBX20基因突变可导致多种不同类型的心血管疾病，包括先天性心脏病如法洛四联症、室间隔缺损、房间隔缺损、房室共同通道、主动脉缩窄、动脉导管未闭、右室双流出道、异常肺静脉连接、心脏瓣膜畸形及扩张性心肌病[1,19]。本研究提示TBX20基因功能丧失性突变可诱发散发性孤立性房颤，从而扩大了TBX20基因突变的表型谱。

总之，本研究识别出1种新的TBX20基因功能丧失性突变，该突变可诱发房颤，为部分房颤的精准防治提供了新的分子靶标。

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