清肺饮治疗急性咽炎模型大鼠的药效及代谢组学研究

雷燕莉 唐焓嫣 时政 刘日慧 邓梦雨 吴磊 刘涛

摘要：目的 研究清肺饮对急性咽炎大鼠的药效作用，阐明其作用机制。方法 在清肺饮治疗氨水诱导的急性咽炎大鼠药效试验基础上，通过UPLC-Q-TOF-MS代谢组学技术，结合多元数据统计筛选清肺饮治疗氨水诱导的急性咽炎大鼠的潜在生物标志物，进一步分析相关代谢通路。结果 血常规、血清炎性因子、病理切片结果均表明清肺饮对于氨水诱导的急性咽炎大鼠具有良好的治疗效果。血清代谢组学共筛选出 10个清肺饮治疗急性咽炎的内源性生物标志物，可能通过牛磺酸和次牛磺酸代谢，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解和嘧啶代谢4条重要代谢通路发挥药效。结论 清肺饮具有治疗急性咽炎的作用，可能的机制为调控牛磺酸和次牛磺酸代谢，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解和嘧啶代谢4条重要代谢通路发挥药效，为临床进一步应用该药提供参考。

关键词：急性咽炎；
清肺饮；
潜在生物标志物；
代谢通路

中图分类号：R285文献标志码：A

Pharmacodynamics and metabonomics of Qingfei decoction in treating acute pharyngitis model rats

Lei Yanli1， Tang Hanyan1， Shi Zheng2， Liu Rihui1， Deng Mengyu1，  Wu Lei1， and Liu Tao3，4

（1 College of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106; 2 Affiliated Hospital of Chengdu University， Chengdu 610081;

3 College of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106; 4 Engineering Technology Research Center of Antiviral Traditional Chinese Medicine Industrialization，  Chengdu 610106）

Abstract Objective To study the pharmacodynamic effect of Qingfei decoction on acute pharyngitis rats and clarify its mechanism. Methods Based on the efficacy test of Qingfei decoction in treating acute pharyngitis induced by ammonia water in rats， the potential biomarkers of Qingfei decoction in treating acute pharyngitis induced by ammonia water in rats were screened by UPLC-Q-TOF-MS metabonomics technology combined with multivariate data statistics， and the related metabolic pathways were further analyzed. Results The results of the blood routine， serum inflammatory factors， and pathological section showed that Qingfei decoction had a good therapeutic effect on acute pharyngitis induced by ammonia water in rats. Ten endogenous biomarkers of Qingfei decoction in the treatment of acute pharyngitis were screened out by serum metabonomics， which may play a role through four important metabolic pathways：
Taurine and hypotaurine metabolism， primary bile acid biosynthesis， valine， leucine and isoleucine degradation， and pyrimidine metabolism. Conclusion Qingfei decoction has the effect of treating acute pharyngitis， and the possible mechanisms are regulation of taurine and hypotaurine metabolism， biosynthesis of primary bile acids， degradation of valine， leucine and isoleucine， and pyrimidine metabolism， which provide references for further clinical application of this medicine.

Key words Acute pharyngitis; Qingfei decoction; Potential biomarkers; Metabolic pathway

急性咽炎（acute pharyngitis，AP）为咽部黏膜及黏膜下组织的突发性炎症，常涉及淋巴组织[1]，病因包括感染性因素（如病毒、细菌、支原体和衣原体等感染）和非感染性因素（如粉尘、烟雾、刺激性气体和机械刺激等）[2-3]。其临床常表现为咽痛、咽干和咳嗽等症状[4]。急性咽炎模型通常使用氨水等刺激物建立，用来模拟环境污染或不健康的生活方式[5]。在中医治疗中，急性咽炎属于中医学“急喉痹”范畴。本病起病急，变化迅速，若不及时治疗，极易引起中耳炎、鼻窦炎和喉炎等疾病[6]。西医治疗中，临床治疗多使用糖皮质激素、抗生素和非甾体类抗炎药，存在较为明显的副作用[7-8]。一直以来，中医药疗法在应对急性病症方面显示了独特的优势[9]，特别是流感、热病等，用中医药治疗疾病对替代抗生素、遏制耐药具有积极意义[10]。

清肺饮处方来源于成都大学附属医院的中药复方制剂临床经验方，全方由罗汉果、西青果和百合等7味药材组成，具有润喉利咽、清肺化痰、润肺止咳和补肺生津等功效，且在以往的咽炎治疗中显示了良好的临床疗效，但其作用机制不清、体内代谢途径不明。中药复方作为中药临床应用的重要形式，探索其作用机制在中药复方研究中至关重要[11]。

代谢组学作为后基因组时代的新技术，是系统生物学的重要组成部分，其具有的动态性、整体性研究体系与中医药的“整体观”研究思想不谋而合，和中医药多靶点、多途径的作用特点相吻合[12]。采用代谢组学方法，可以筛选得到与药效作用有关的潜在生物标志物，从而进一步进行相关代谢途径分析[13]。因此，本研究从整体出发，采用代谢组学研究方法，探究清肺饮治疗咽炎模型大鼠前后血清代谢物的变化，分析发挥药效的作用机制，明确清肺饮治疗急性咽炎的潜在生物标志物和代谢通路，为其后续的清肺饮的临床开发和急性咽炎的治疗提供依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD大鼠56只，雌雄各半，6～8周，体重（200±20） g，购于成都达硕实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（川）2020-030。普通饲料喂养，自由饮水。

1.2 药品与试剂

清肺饮中间体（20230322）；
阿莫西林胶囊购于石药集团中诺药业（石家庄）有限公司（批号1882221284）；
氨水（分析纯）、水合氯醛（分析纯）购于成都市科隆化学试剂有限公司；
乙酸铵（质谱纯）购于美国Honeywell公司；
乙腈、甲醇（质谱纯）购于美国 Thermo Fischer公司。

肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号A38230363）、白细胞介素1β（IL-1β，批号A30130437）、白细胞介素6（IL-6，批号A30630482）、白细胞介素10（IL-10，批号A31030365）试剂盒均购于杭州联科生物技术股份有限公司。

1.3 主要仪器

TEK-VET5血液细胞分析仪（江西特康科技有限公司）；
SAF-680T型酶标仪（上海巴玖公司）；
JB-L5包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；
RM2016切片机（上海徕卡仪器有限公司）；
DM500正置光学显微镜（上海徕卡仪器有限公司）；
LC-30A型超高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；
Triple TOF 6600型四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪（美国 AB SCIEX公司）。

2 方法

2.1 清肺饮中间体粉末的制备

按处方量，罗汉果等加入12.15倍水提取3次，每次1.5 h，鱼腥草等加入18倍水提取4 h，合并滤液，80 ℃减压浓缩至相对密度为1.05的浸膏，95%乙醇醇沉至最终醇浓度为60%，静置24 h后抽滤，醇沉液在80 ℃下减压浓缩后于80 ℃减压干燥，提取物得率为26.28%。

2.2 造模与分组

选用56只SD大鼠，雌雄各半，适应性喂养5 d 后，除空白组（NC）和空白给药组（NC-MD）外，使用喉头喷雾器向造模组大鼠咽部喷15%氨水，3揿/次，2次/d，连续3 d，建立急性咽炎模型[14-15]，空白组（NC）和空白给药组（NC-MD）喷纯净水作为对照。造模成功后，造模组大鼠随机分为模型组（MX）、阿莫西林（Amoxicillin）（0.3 g/kg）组和清肺饮高（HD）（2.76 g/kg）、中（MD）（1.38 g/kg）、低剂量（LD）（0.69 g/kg）组。各给药组ig相应药物，1次/d，连续5 d，对照组和模型组 ig等体积的0.5% CMC-Na。给药结束后，大鼠禁食不禁水12 h，ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）进行麻醉，每组随机取6只大鼠全血、血清和咽部组织，于低温下保存备用。

2.3 行为学及咽部表观状态观察[16]

记录各组大鼠的体重，每天根据大鼠的脱毛程度、毛发状态和咽部红肿程度等观察并记录造模后大鼠的行为状态。造模后，观察各组大鼠毛发情况、精神状况、活动情况、饮水量等，额带反光镜下观察咽部黏膜情况。

2.4 血常规检测

取各组大鼠腹主动脉血1 mL，置于EDTA的采血管中。采用TEK-VET5血液细胞分析仪测定全血白细胞（WBC）、淋巴细胞（LYMP）数目。

2.5 血清炎症因子指标检测

取各组大鼠腹腔主动脉血，4 ℃静置60 min，3500 r/min离心15 min，取上层血清，采用ELISA法测定各组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平。

2.6 咽部组织病理形态学检测

取各组大鼠咽部组织，4%多聚甲醛固定、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，制得3 μm石蜡切片，HE染色，中性树脂封片干燥，光镜观察咽部组织形态学改变。

2.7 代谢组学分析

2.7.1 UPLC-Q-TOF-MS分析

（1）血清样本处理：将用液氮速冻后并保存于-80 ℃的正常组、模型组和清肺饮中剂量组的血清样本于常温解冻，取100 μL样本加入已预冷的甲醇-乙腈溶液（1：1，V/V）400 μL，涡旋混合30 s，低温超声10 min，-20 ℃静置60 min，12000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液用氮气吹干。质谱分析时加入乙腈-水（1：1，V/V）100 μL复溶，涡旋，14000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液进样分析。

（2）色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm），流动相为乙腈（A）-25 mmol/L乙酸铵水溶液（B）梯度洗脱（0～2 min，95% A；
2～18 min，95%～65% A；
18～20 min，65%～40% A；
20～22 min，40% A；
22～22.1 min，40%～95% A；
22.1～30 min，95% A），流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量1 μL。

（3）质谱条件：点喷雾离子源（ESI），喷雾电压（IS）分别为+5500 V，﹣4500 V；
离子源温度（TEMP）为550 ℃；
簇裂解电压（DP）为80 V；
碰撞能量（CE）为35 V；
碰撞能量扩展（CES）为15 V；
雾化气压力（GS1）和辅助气压力（GS2）为55psi；
气帘压力（CUR）为35psi；
检测模式为开启动态背景扣除（DBS）的信息关联数据采集模式（IDA）。

2.7.2 数据处理与分析

将LC-MS/MS采集的质谱原始数据使用Analyst? TF 1.6、 PeakView 2.0等软件进行数据预处理，得到包括质荷比、保留时间及峰面积等信息的数据矩阵[17]，采用ZhuLab实验室、KEGG等数据库鉴定代谢物。使用SIMCA 14.1软件进行样本的主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），以变量投影重要性（VIP）>1和t检验（P<0. 05）为标准筛选差异代谢物。将满足标准的化合物作为差异代谢物，并导入MetaboAnalyst 5.0数据平台进行进一步的代谢通路分析。

3 结果

3.1 行为学及咽部表观状态观察结果

从造模第1天开始，造模组大鼠出现挠嘴症状，造模第2～3天症状明显，唇周有抓挠血痕，毛发无光泽，出现喘息急促，饮水增多，食量减小等现象。造模3 d后咽部有红肿现象出现，即造模成功。在给予药物治疗5 d后，与模型组比较，各给药组大鼠咽部红肿情况有所好转，说明清肺饮对急性咽炎有较好的治疗效果。

3.2 血常规结果

白细胞和淋巴细胞是炎症反应的效应器官，血液中其数目的多少可以反应炎症状况。与正常组相比，模型组大鼠白细胞（WBC）数目和淋巴细胞（LYMP）数目显著增加，空白给药组无显著变化；
与模型组相比，阿莫西林组、清肺饮高、中、低剂量组大鼠白细胞、淋巴细胞数目均显著降低，见图1。

3.3 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和 IL-10 水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α 促炎因子水平显著升高（P＜0.01），与模型组相比，各给药组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平均显著降低。对照组、模型组和各给药组血清中抑炎因子IL-10均无显著性差异，见图2。

3.4 各组大鼠咽部组织形态学结果

空白组黏膜层和肌层结构清晰，分界明显，整体染色较均匀，未见炎性渗出物，上皮细胞无变性、坏死、炎症，腺体未见增生、萎缩等病理变化；
较于空白组，空白给药组基本相同。模型组上皮增生增厚（绿色箭头），少量炎细胞浸润（蓝色箭头），黏膜下层腺体萎缩较明显，结缔组织内见散在较多炎细胞浸润。相较于模型组，各给药组均有一定改善。阿莫西林组偶见上皮增生情况，炎细胞不明显，固有层内炎细胞浸润减少；
高、中、剂量组样本改善情况均较好，上皮增生情况较少，固有层内无明显炎细胞浸润，腺体萎缩情况较少，见图3。以上结果说明清肺饮可以使氨水诱导的急性咽炎大鼠损伤的咽部组织得到明显的恢复。

3.5 代谢组学研究

3.5.1 UPLC-Q-TOF-MS分析

正常组、模型组、中剂量组大鼠血清样本和QC样本在正、负离子模式下的总离子流图，见图4。

3.5.2 PCA和OPLS-DA分析

分别将各组代谢组学数据进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），PCA 结果显示，正、负离子模式下，QC样本集聚良好，表明仪器分析系统稳定性良好；
PCA和OPLS-DA 结果显示，正、负离子模式下，正常组、模型组及清肺饮中剂量组3组样本能显著区分开，表明各组间血清代谢轮廓有明显差异，即各组间内源性代谢物发生了显著变化，见图5。

OPLS-DA得分图及模型验证图见图6～7。正离子模式下，OPLS-DA得分图显示空白组和模型组组间血清样本，清肺饮中剂量组和模型组组间血清样品均可明显分离，模型参数如下表1，Q2>0.5时可认为是有效的模型，说明该模型的数据有效可靠，具有良好的预测能力[18]。各模型进行随机置换测试（n=200），结果表明 OPLS-DA 模型不存在过拟合的情况，各模型的建模结果可靠。

3.5.3 差异代谢物分析

结合VIP >1和P<0. 05的筛选条件，根据代谢物的保留时间、一级质谱及二级质谱碎片等信息，利用KEGG数据库和Zhulab代谢组学数据平台进行差异代谢物定性鉴别。模型组与对照组有73个差异代谢物，为急性咽炎大鼠潜在血清生物标志物；
中剂量组与模型组有73个差异代谢物，为治疗急性咽炎大鼠潜在血清生物标志物，其中10个为急性咽炎大鼠血清生物标志物。10个代谢物中，9个在模型组呈上调趋势，1个呈下调趋势，经清肺饮中剂量给药治疗后，均呈现回调趋势，见表2。

3.5.4 代谢通路分析

将10个共同的差异代谢物输入MetaboAnalyst 5.0平台中进行代谢通路分析，筛选出6条代谢通路，其中4条impact＞0 ，分别为牛磺酸和次牛磺酸代谢，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解和嘧啶代谢，见表3，代谢通路网络见图8。此外，将其余63个治疗急性咽炎大鼠的潜在血清生物标志物进行代谢通路分析，得到包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、戊糖和葡糖醛酸的相互转化、色氨酸代谢在内的16条代谢通路，其中10条impact＞0，代谢通路网络见图 9。

4 讨论

本研究通过氨水诱导建立大鼠急性咽炎模型，考察了清肺饮对大鼠白细胞和淋巴细胞、血清炎症因子、病理切片的影响。目前，相关研究多采用咽部黏膜注射乙型溶血性链球菌和咽部黏膜氨水喷雾刺激两种方法制备大鼠急性咽炎模型[19]，前者主要是模拟感染性因素导致的急性咽炎，后者主要是模拟非感染因素（物理刺激）导致的急性咽炎。相比于注射乙型溶血性链球菌感染模型，氨水致炎模型较为简便、安全，且更符合人们日常生活中辛辣、刺激饮食的不良习惯，故本研究采用氨水致炎模型。结果表明清肺饮高、中低剂量组给药治疗后，体征较模型组比有明显好转，白细胞和淋巴细胞数目均有不同程度的降低，血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子水平均显著降低，病理切片中咽部组织的炎性反应降低。空白给药组与空白组各指标无明显差异，说明清肺饮对正常大鼠无致炎反应。以上结果说明清肺饮对急性咽炎大鼠有良好的治疗作用。

为进一步探究清肺饮治疗急性咽炎的作用机制，研究采用代谢组学相关方法，利用质谱技术检测了清肺饮中剂量组、模型组和正常大鼠血清代谢物的变化。与空白组比较，模型组在正、负离子模式下共73个代谢物发生显著性改变，与模型组相比，清肺饮中剂量组在正、负离子模式下也共有73个差异代谢物。清肺饮中剂量治疗后，3-甲基-2-氧代戊酸、牛磺酸、尿苷等10个共同差异代谢物较模型组回调，说明这10个代谢成分可能为清肺饮治疗急性咽炎大鼠的血清生物标志物，主要涉及有牛磺酸和次牛磺酸代谢，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解和嘧啶代谢4条代谢通路，代谢通路中涉及代谢物为牛磺酸、尿苷和3-甲基-2-氧代戊酸，表明这3种代谢物在清肺饮中剂量治疗急性咽炎大鼠时具有极其重要的作用。

牛磺酸是一种在大多数动物组织中表达的非蛋白质氨基酸，可影响细胞功能，包括渗透调节，抗氧化，胆汁酸结合等[20]。研究表明，其能够通过抑制胆汁酸膜受体介导的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）来发挥其抗炎、免疫调节的作用[21]。此外，牛磺酸也在炎症反应中可通过卤化反应生成牛磺酸氯胺，从而抑制炎症介质的产生，增加抗氧化蛋白的表达，发挥抗炎和细胞保护的作用[22]。本研究中有牛磺酸参与的牛磺酸和次牛磺酸代谢、初级胆汁酸生物合成介导了急性咽炎的发生和发展，可能为治疗急性咽炎的关键途径。尿苷是嘧啶合成代谢的中间体，与核酸代谢相关[23]，本研究表明急性咽炎的发生可能与嘧啶代谢紊乱相关。此外，相对于模型组，清肺饮中剂量组的其余63个差异代谢物涉及通路有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、戊糖和葡糖醛酸的相互转化、色氨酸代谢等16个代谢通路。

综上所述，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术，血清代谢组学方法，发现清肺饮对急性咽炎大鼠具有良好疗效，是通过多成分、多靶点、多途径共同调控的结果，符合中药多成分、多靶点、多通路协同发挥作用的整体观点[24]。

近年来，中医方法的血清药物化学与代谢组学相结合，建立了一种创新的中药组学策略，能够探索证候生物标志物并评估中医疗效，发现药效物质[25]。同时，中药药效物质也是研究中药临床疗效的关键，对新药研发和中药质量标准的研究都具有着重大意义[26]。本研究后续将对清肺饮治疗急性咽炎的药效物质进行进一步分析，探究其入血成分，将血清药物化学与代谢组学相结合，明确其“物质-效应”机制，为清肺饮的临床利用提供依据。

参 考 文 献

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