乐果和苦参碱农药在柞蚕幼虫体内的代谢研究

张春杨 宫田娇 张海东 郭鸿儒 周 影 杨淑芳

(吉林省蚕业科学研究院,吉林吉林 132012)

柞蚕 (Antheraeapernyi)作为一种具有重要经济价值的资源昆虫,在我国多个省份均有放养。然而,近年来吉林地区多斑柞跳象、天幕毛虫、柞蚕饰腹寄蝇等柞树害虫危害严重,对柞蚕生产造成极大影响。为了减轻虫害,蚕场普遍采用喷洒农药的方法,但柞蚕与天幕毛虫同属于鳞翅目,故柞蚕中毒现象屡见不鲜,严重影响了蚕业经济的发展。

乐果作为一种有机磷类杀虫剂,其杀虫机理是抑制害虫乙酰胆碱酯酶的活性,对昆虫具有胃毒、触杀、熏蒸等作用,一直是防治多斑柞跳象、柞蚕饰腹寄蝇的主要药剂。柞蚕接触到乐果后,可能会出现体躯翻转、扭曲、吐液、偶有脱肛等情况,最终可能导致死亡。

苦参碱是由苦参提取制成的天然植物源类生物农药,以苦参碱、氧化苦参碱含量最高,对害虫具有触杀、拒食、麻痹神经中枢系统等生物活性。苦参碱因其为广谱杀虫剂但对人畜低毒且能在大自然中快速降解的特性,已在多省市地区作为绿色防控技术药品予以推广,大范围应用于小麦、玉米、茶叶等农作物的害虫防治。然而,有研究发现虽然不同龄期柞蚕幼虫对苦参碱农药的耐受度不同,但其LC50均低于生产推荐使用浓度[1]。

为了进一步探究两种农药在柞蚕体内的代谢和消除规律,为蚕场农药的施用提供参考,本文以五龄第3天柞蚕为试虫,将高、低两个剂量的乐果和苦参碱通过浸叶法[2]对试虫进行一次经口染毒。通过对试虫体内乐果和苦参碱含量的测定,了解试虫对两种农药吸收的速度、在体内存留时间的长短、分布特征和从机体清除的速度,以便进一步评估乐果和苦参碱农药的施用对柞蚕的毒性风险。

1.1 供试材料

供试柞蚕品种109,由吉林省蚕业科学研究院柞蚕育种室提供。

1.2 供试药品

乐果,有效成分含量40.0%,兽药字060082920,辽宁凤凰蚕药厂产品;苦参碱,有效成分含量1.3%,山东省乳山韩威生物科技有限公司产品。

1.3 仪器与试剂

API4000+超高效液相色谱-串联质谱联用仪(ESI离子源,美国AB SCIEX公司);涡旋混合器(美国Talboys);KQ-500DE超声波清洗器 (昆山超声仪器);KH20R-Ⅱ高速冷冻离心机(湖南凯达); TTL-DC吹氮仪(北京同泰联科技);乐果溶液标准物质(1.00 mg/mL,中国计量科学研究院);苦参碱标准物质(纯度98.9%,上海安普实验科技),氧化苦参碱标准物质(纯度99.9%,天津阿尔塔科技);色谱纯甲醇、乙腈(Fisher Scientific);色谱纯甲酸(CNW);分析纯无水硫酸钠(北京化工);QuEChERS试剂净化管(5982-5256安捷伦公司):15 mL离心管内装147.7 mg PSA,15.1 mg GCB,887.2 mg 硫酸镁;QuEChERS试剂提取包:内含硫酸镁4 g,氯化钠1 g,二水柠檬酸三钠1 g,柠檬酸氢二钠0.5 g( Waters公司);固相萃取净化柱OasisPRIME HLB Plus Short(335 mg)柱(Waters公司);0.1%甲酸—水溶液;0.1%甲酸—甲醇液;50%甲醇水溶液(含0.1%甲酸);80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸); 0.2 μm滤膜(Pall Corporation)。

1.4 药物处理及样本采集

取5龄眠起第3天柞蚕幼虫,体重8～9 g,空腹12 h,设置3次重复处理,每次重复选取10头发育程度一致的健康柞蚕幼虫,在自然条件下室内插枝饲养。用足量的2 g/L乐果、0.000 06 g/L苦参碱溶液浸渍后阴干的柞树叶一次性饲喂,并设置高低两个剂量。其中低剂量组的给药剂量为40 g/kg体重,高剂量组为80 g/kg体重。进口染毒后更换正常新鲜柞树叶饲喂,乐果组于给药后0 h、1 h、2 h、3 h、6 h、24 h、3 d、5 d、10 d取试虫待测,苦参碱组于给药后0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、6 h、24 h、72 h取试虫待测。所有待测样本于-20 ℃保存。

1.5 数据处理

药代谢动力学的药时数据使用DAS3.2.8软件非房室模型进行分析。

2.1 样品处理Ⅰ

2.1.1 样品提取Ⅰ

称取2.50 g(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中,加入80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)10 mL,涡旋1 min,超声提取20 min,向离心管中加QuEChERS试剂提取盐,再涡旋提取2 min后,在4 ℃下9 500 r/min离心5 min,上清液待净化。

2.1.2 样品净化Ⅰ

用5 mL注射器抽取4 mL提取液,过OasisPRIME HLB Plus Short(335 mg)柱,弃去前面1.0 mL样液,收集后面的净化液备用。再准确吸取2.00 mL净化液于10 mL浓缩管中,于40 ℃水浴中氮吹至近干,准确加入1.0 mL 50%甲醇溶液(含0.1%甲酸)溶解残渣,涡旋30 s,超声2 min,涡旋1 min后,将溶液转移至1.5 mL离心管中,13 000 r/min离心5 min,上清液过0.22 μm滤膜后,进行液相色谱-串联质谱测定。

2.2 液相色谱-质谱/质谱条件Ⅰ

2.2.1 色谱条件Ⅰ

Kinetex2.6 μm Biphenyl 100Å色谱柱(100mm×3.0mm);柱温40 ℃;流速:0.4 mL/min;进样量:5 μL;流动相,A泵为 0.1% (V/V)甲酸—水,B泵为0.1% (V/V)甲酸—甲醇。流动相及梯度洗脱条件见表1。

2.2.2 质谱条件Ⅰ

离子源:ESI。扫描方式:正离子模式多反应监测(+MRM)。离子源参数:电喷雾电压(IS)5 500 V;雾化气压力(GS1)60 Psi;辅助气压力(GS2)60 Psi;气帘气压力(CUR)30 Psi。离子源温度(TEM)550 ℃;喷撞气(CAD)7 mL/min。监测离子对、碰撞气能量和去簇电压参数见表2。

表2 乐果监测离子对、碰撞气能量和去簇电压参数

3.1 样品处理Ⅱ

3.1.1 样品提取Ⅱ

称取经充分粉碎、混合均匀的试样2.50 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)10 mL,涡旋1 min,超声提取20 min,向离心管中加5.0 g无水硫酸钠,再涡旋提取2 min后,9 500 r/min离心5 min(4 ℃),上清液待净化。

3.1.2 样品净化Ⅱ

吸取5.0 mL上清提取液加入到安捷伦QuEChERS试剂净化管中(15 mL离心管内装147.7 mg PSA,15.1 mg GCB,887.2 mg硫酸镁),涡旋2 min,5 000 r/min离心5 min(4 ℃)。准确吸取2.00 mL净化液于10 mL浓缩管中,于40 ℃水浴中氮吹至近干,准确加入1.0 mL 50%甲醇溶液(含0.1%甲酸)溶解残渣,涡旋30 s,超声2 min,涡旋1 min后,将溶液转移至1.5 mL离心管中,13 000 r/min离心5 min,上清液过0.22 μm滤膜后,进行液相色谱-串联质谱测定。

3.2 液相色谱-质谱/质谱条件Ⅱ

3.2.1 色谱条件Ⅱ

Kinetex2.6 μm Biphenyl 100 Å色谱柱(100 mm×3.0 mm);柱温40 ℃;流速0.4 mL/min;进样量5 μL;流动相,A泵为 0.1%甲酸—水,B泵为0.1%甲酸—甲醇。流动相及梯度洗脱条件同乐果。

3.2.2 质谱条件Ⅱ

离子源:ESI。扫描方式:正离子模式多反应监测(+MRM)。离子源参数:电喷雾电压(IS)5 500 V;雾化气压力(GS1)413 700 Pa;辅助气压力(GS2)413 700 Pa;气帘气压力(CUR)206 850 Pa。离子源温度(TEM)550 ℃;碰撞气(CAD)7 mL/min。监测离子对、碰撞气能量和去簇电压参数见表3。

表3 苦参碱监测离子对、碰撞气能量和去簇电压参数

4.1 乐果在柞蚕幼虫体内的代谢及消除情况

乐果在试虫体内的体药含量见表4,C-T实测值群体曲线见图1,代谢动力学非房室模型统计矩参数见表5。

A—低剂量组 B—高剂量组图1 乐果在试虫体内的C-T曲线图

表4 乐果体药含量

表5 乐果非房室模型统计矩参数

以上数据显示,低剂量组的Tmax和AUC值均大于高剂量组;而Cmax、MRT和t1/2β值小于高剂量组。结合体药含量及C-T曲线图的结果可以发现低剂量乐果农药在试虫体内驻留能力强,衰减速度慢,而高剂量则相反。这可能与乐果农药的致毒机理有关,即有机磷农药中毒的毒性作用是使乙酰胆碱聚集引起胆碱能神经先兴奋后抑制。高剂量的乐果使试虫体内乙酰胆碱短期大量聚集,蚕体更加兴奋,活动量大,从而加速了体内乐果的代谢。

4.2 苦参碱在柞蚕幼虫体内的代谢及消除情况

苦参碱在在试虫体内的体药含量见表6,C-T实测值群体曲线见图2。代谢动力学非房室模型统计矩参数见表7。

A—低剂量组 B—高剂量组图2 苦参碱在试虫体内的C-T曲线图

表6 苦参碱体药含量

表7 苦参碱非房室模型统计矩参数

以上数据显示,高低剂量组试虫体内苦参碱含量均在1 h 达到最大峰值,但其 t1/2β差距显著,且低剂量组Cmax约为高剂量组的1.5倍。低剂量组试虫体内苦参碱含量在2-3 h间出现大幅度衰减,6 h时已低于检出限;但高剂量组在24 h仍能从试虫体内测得苦参碱。说明苦参碱农药起效快,易被蚕体吸收和分布,但是高剂量的苦参碱农药相比低剂量,其在试虫体内存留能力更强、持续作用时间长。一方面可能是与苦参碱会导致染毒试虫拒食、神经中枢系统麻痹有关。另一方面也可能由于苦参碱不仅具有水溶性,在碱性条件下脂溶性也有较好的理化性质[3],未经吸收的苦参碱在柞蚕中肠碱性条件下被重新持续吸收。说明在蚕场病虫害防治过程中,即使在安全浓度下也应谨慎的使用苦参碱农药。

本研究利用LC-MS/MS检测经口一次性染毒的柞蚕幼虫体内的药物浓度,通过对其代谢动力学结果分析,初步了解了两个剂量水平的乐果和苦参碱在柞蚕幼虫体内的代谢情况,这些结果可以为蚕场农药的合理施用提供参考,以减少柞蚕幼虫体内农药的残留和积累。实验过程中乐果和苦参碱溶液的浓度是参考了本课题组前期实验中72 h的LC50[1]。本研究采用柞蚕幼虫体药浓度的方法进行药物代谢分析,在以后的实验中可根据研究需要取蚕体不同组织分别进行研究。本实验使用的检测方法中苦参碱最低检出限为 0.05 μg/kg,氧化苦参碱最低检出限为 0.1 μg/kg[4]。两种农药检测方法的方法学验证均满足 GB/T 27404—2008 《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录中对精密度、回收率的要求。

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