AlkB蛋白介导的核酸去甲基化在植物中的研究进展

●周 颖

（重庆大学生物工程学院 重庆 404100）

AlkB蛋白介导的核酸去甲基化属于表观遗传领域，是当今医学上的一个热门研究方向，已在癌症早筛、伴随诊断、药物研发上有所应用，如m6A去甲基化酶FTO可运用在抑制白血病细胞增殖上，有望成为白血病新的分子治疗靶点和临床预后指标[1]；
ALKBH5抑制物可用于治疗病毒感染性疾病或与病毒感染相关的疾病[2]。但是到目前为止，关于其家族去甲基化的研究主要集中在人和哺乳动物，对植物的研究则相对较少，通过综述该家族蛋白在植物领域的最新研究进展，以期为其植物领域上的研究提供理论依据。

甲基化是核酸化学修饰中最多的一种，它不改变基因的序列，却对基因表达、细胞命运及个体发育等过程起到关键的调控作用。目前，已报道发生在 DNA上的甲基化修饰有3种：5-甲基胞嘧啶（5-mC），是最重要的一种DNA甲基化修饰，广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中，被称为“第五碱基”；
5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），也称哺乳动物的“第六碱基”；
N6-甲基腺嘌呤（N6-mA），最先在小鼠胚胎干细胞DNA修饰中被发现，也存在于细菌、藻类及动植物基因组中。已报道发生在RNA上的甲基化有3种：N6-腺苷酸甲基化（m6A），是RNA上最丰富的一种修饰，存在于大多数真核生物和一些病毒的mRNA中，也存在于tRNA、rRNA、snRNA以及lncRNA中；
N1-腺苷酸甲基化（m1A）；
胞嘧啶羟基化（m5C）。同时，人们对与甲基化相对应的去甲基化过程越来越感兴趣，研究发现了一种蛋白——AlkB，它可以去除DNA、RNA中的甲基和其他烷基，实现核酸化学修饰的可逆性。

1983年，Kataoka等[3]发现大肠杆菌突变菌株对甲基磺酸甲酯（MMS）十分敏感，并将该潜在功能基因命名为AlkB。随后分析证实了AlkB是铁（II）和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶超家族，它以亚铁离子为辅因子，α-酮戊二酸为共底物进行各种氧化反应，进而去除DNA、RNA中的甲基和其他烷基，实现核酸化学修饰的可逆性。

大多数AlkB家族成员都包含一个由200～300个氨基酸组成的“Jelly-roll”拓扑结构，即AlkB结构域，其主要由两个β折叠片组成，也称双链β-螺旋（DSBH）。在DSBH核心“开放端”的组氨酸-X-天冬氨酸（HXD）基序，以及其下游的第二个组氨酸是这个家族中高度保守的基序。HXD这三个残基能催化铁原子的配位，并且α-酮戊二酸辅因子的两个氧原子也能进一步形成铁的八面体配位。DSBH上的最后一个β折叠始末有两个保守的精氨酸残基，能与2-OG形成盐桥相互作用，进一步稳定α-酮戊二酸的结合[4]。该家族还存在一个保守的核苷酸识别盖，由一个小的β折叠组成，有助于识别底物特异性。除了催化、识别上具有保守性质外，AlkB家族的碱基结合成员还有一个特征，就是所结合的残基都是有芳香堆积在受损碱基上，尽管在不同的家族成员之间没有严格保守的芳香残基类型。

近些年，AlkB家族蛋白的生物学功能、生化活性和结构特征主要集中在哺乳动物与大肠杆菌上进行研究，在植物中的报道很少。目前，在拟南芥中共鉴定出13个AlkB家族基因，即：ALKBH1A、ALKBH1B、ALKBH1C、ALKBH1D、ALKBH2、ALKBH6、ALKBH8A、ALKBH8B、ALKBH9A、ALKBH9B、ALKBH9C、ALKBH10A和ALKBH10B。其中ALKBH9A、ALKBH9B、ALKBH9C、ALKBH10A和ALKBH10B具有与人类 ALKBH5蛋白最相似的氨基酸序列。

拟南芥AtALKBH2蛋白对DNA中的甲基和乙烯加合物表现出体外修复活性，敲除AtALKBH2基因后植株对甲基化诱变剂MMS敏感，种子、叶片形状不正常，细胞坏死增加，说明AtALKBH2能够保护拟南芥免受DNA甲基化损伤，与其他AlkB同系物一样，在拟南芥中行使去甲基化功能[5]。AtALKBH6为潜在的去甲基化酶，具有与m6A和m5C RNA结合的能力，在种子萌发、幼苗生长和非生物胁迫中发挥重要作用[6]。AtALKBH8A与哺乳动物ALKBH8的功能类似，参与成熟tRNA的加工[7]。AtALKBH8B在拟南芥对盐胁迫和脱落酸（ABA）的反应中起作用。AtALKBH8B过表达的转基因拟南芥植株表现出耐盐性，与野生相比，AtALKBH8B过表达转基因植株的总m6A水平降低。外源施加ABA后，AtALKBH8B突变体植株的子叶绿化和幼苗生长远高于野生型[8]。AtALKBH9B具有6-meA去甲基化酶活，并与苜蓿花叶病毒的外壳蛋白相互作用，最终影响病毒感染[9]。拟南芥中敲除ALKBH10B，增加了开花激活因子（FT）及其上游基因SPL3和SPL9的m6A修饰，高甲基化的mRNA加速衰变，从而表现出开花延迟，营养生长受到抑制的表型[10]。在含有2μ、4μ的ABA培养基上，AtALKB10B突变体的根长受到明显的抑制，检测发现ABI3和ABI4基因表达量上调，说明AtALKB10B还与ABA相关。AtALKBH10B突变体的还表现出耐盐表型，在盐胁迫下ATAF1、BGLU22和MYB73的表达量下调[11]。

随后，其他植物中的AlkB蛋白也陆续被发现。西瓜ClALKBH2B和ClALKBH4B受不同的转录因子调控，且ClALKBH4B 基因可抑制黄瓜绿斑驳花叶病毒积累[12]。水稻OsALKBH1对ss DNA的m1d A具有去甲基化的酶活，且其酶活强于m6dA，并通过EMSA等实验证明OsALKBH1与ss DNA、ds DNA存在互作[13]。番茄中的SLALKBH2可介导6-meA去甲基化酶通过稳定SlDML2mRNA的水平来促进番茄果实成熟[14]。番茄SLALKBH3可以通过影响3"UTR区域中乙烯相关基因的m6A修饰的表达量来调控番茄花柄脱落[15]。番茄中还存在一个与哺乳动物ALKBH2同源的蛋白，序列号为XP_004236651，对该基因敲除，发现突变体植株对DNA甲基化剂MMS高度敏感，具体表现在幼苗的生长延缓、种子发芽率低、离体叶片快速衰老以及畸形率升高，并且敲除该同源基因还会导致具有高转录活性的rDNA甲基化程度升高[16]。

近年来，随着新一代测序技术的发展，在分析ALKB家族蛋白以及去甲基化方面取得了很大进展，但是也存在一些疑问。比如拟南芥的AtALKBH10B虽属ALKB同源物，但并不具有该家族铁（II）和α-酮戊二酸依赖性双加氧的典型的结构域，却也同样具有去甲基化的功能，那么猜测是否该家族还存在其他发挥作用的位点亦或是其他原因。此外，在植物生长发育的各阶段中，ALKB受什么信号调控、何时发生去甲基化、如何维持植物体内甲基化与去甲基化的动态平衡等，还需要未来进一步研究，进而在农业生产上有更好运用。

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