基于ISSR标记的蜂糖李亲缘关系分析

麦鹏坤, 郑乾明, 赵雅楠, 张 敏, 马玉华

(1.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院,山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室,山地生态与农业生物工程协同创新中心, 贵阳 550025;2.贵州省农业科学院果树科学研究所, 贵阳 550006)

蜂糖李(Prunussalicina"Fengtangli")为蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)李属(Prunus)植物,蜂糖李肉质细,清脆爽口,汁液中多,味浓甜,离核,品质优异,是贵州名特优水果[1],由贵州省安顺市本地李子优株选育而成,起源于贵州省安顺市镇宁县六马镇。2017年,蜂糖李被评为中国国家地理标志保护产品[2],同年,“镇宁蜂糖李”在第四届全国优质李鉴评大会上获得评审专家的一致好评,被评为“全国优质李金奖”。蜂糖李作为贵州独特的地方李品种,因其果实风味浓郁,且带有独特的香气而具有较高的商品价值。现贵州省种植面积约3.67万hm2,安顺种植面积1.4万hm2,投产面积5 580 hm2[1],并推广到广西、四川等省(区)。随着蜂糖李种植面积的迅速扩大,种苗生产混乱、接穗来源异质化,果苗质量得不到保障,果实品质参差不齐,对蜂糖李产业造成不利影响。因此,对贵州蜂糖李进行DNA分子标记技术研究,开展贵州蜂糖李种质资源保护和培育优异品系研究十分重要。

DNA分子标记具有变异位点丰富、遗传稳定、多态性高和受环境影响小等优点,因而被广泛应用于物种种质鉴定、物种遗传多样性分析、品种亲缘关系鉴定、指纹图谱的构建等领域[3]。分子标记中ISSR是简便、快速、易行的分子标记技术[4],引物的设计流程简单,既无需知道扩增位点的信息,又具有比RPAD标记更强的可重复性[5-6]。近年来,ISSR标记已在李属植物遗传多样性研究中得到了广泛应用。经建永等[7]以22份野生欧洲李为材料,利用ISSR对其种质进行了遗传多样性研究,为欧洲李野生种质资源的开发和保护提供了科学的理论依据。方智振等[8]利用ISSR分子标记区分了宁冈和福建芙蓉李,并建立了宁冈芙蓉李与福建芙蓉李的ISSR指纹图谱,为芙蓉李的种质利用提供了依据。目前,基于ISSR分子标记的贵州蜂糖李遗传多样性分析未见相关报道,可见对其分子水平的研究相对滞后。本研究基于ISSR分子标记技术,对采自镇宁县等5个地区的52份蜂糖李种质进行亲缘关系分析,遗传多样性评价,为今后蜂糖李新种质的培育与资源的保存提供参考和技术支持。

1.1 实验材料

本实验所用的52份蜂糖李材料采自贵州省5个不同区(县)(见表1),于2022年7月中旬由同一实验者取样,采集完整无损伤幼嫩叶片分别置于对应的采集袋内,低温下带回实验室,-80 ℃超低温冰箱保存,用于后续基因组DNA提取。

表1 用于ISSR分子标记的52份蜂糖李种质材料

1.2 实验方法

1.2.1蜂糖李基因组DNA的提取

通过植物基因组DNA提取试剂盒DP320(北京,天根,提取方法见试剂盒说明书)提取52份供试材料幼嫩叶片DNA后,根据1%琼脂糖凝胶电泳图,筛选出条带清晰、质量达标的DNA,用于后续群体遗传分析。经紫外分光光度计检测质量及浓度后,将DNA稀释至约40 ng/μL,置于-20 ℃保存防止DNA降解,用于后续实验。

1.2.2引物合成与筛选

选择实验室现有已合成的(University of British Columbia公布的)100条 ISSR 引物(上海生工生物工程公司合成),使用蜂糖李编号为1,3,4,7,9,10,17,34的样品基因组为模板,获得10条重复性好且多态性高的引物用于本研究材料的分析。且进行预实验的多重因素比较。最终优化的ISSR PCR体系的总体积为10 μL,其中含5 μL 天根2×TaqPCR Master Mix Ⅱ、0.8 μL 引物(0.8 μM)、1.2 μL(40 ng/μL)模板DNA,用ddH2O补足至总体积10 μL。ISSR扩增程序参照文献[9]的方法并稍作修改:94 ℃预变性5 min;后经94 ℃变性45 s,50.7～57.9 ℃引物退火45 s,72 ℃延伸1 min,共计循环40次;最后72 ℃延伸10 min;扩增后的产物4 ℃保存。产物由2%琼脂糖凝胶电泳检测,电泳液为1×TAE,用DL2000 Marker为DNA分子量参照标准,电泳电压设为180 V,电泳时间30 min,利用自动凝胶成像系统记录电泳的结果。

1.2.3数据统计与分析

每条ISSR引物实验重复3次,仅统计每条引物扩增出来的清晰且能重复出现的条带。在位点处存在扩增条带的记为“1”,没有则记为“0”。最后获得供试样本对应每个引物的0/1数据矩阵。通过Popgene32[10]软件计算遗传多样性指数,其中包括等位基因数量(Na),有效等位基因数量(Ne),Nei"s基因多样性指数(H)和Shannon"s信息指数(I)。PIC_CALC软件计算多态性信息含量(Polymorphism Information Content PIC)。使用NTSYS2.10根据非加权平均法UPGMA对供试种质进行聚类分析。并利用iTOL(https://itol.embl.de/)进行聚类图美化。

2.1 蜂糖李DNA检测

利用试剂盒提取的52份供试样本的基因组DNA,部分基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。DNA电泳条带距上样孔较近,且条带明亮清晰,不存在拖尾、降解等现象。使用全波长扫描型酶标仪测定所提DNA样品的OD260/OD280值及浓度。结果显示,所提DNA的OD260/OD280值在1.75～1.93之间,浓度在85～457 ng/μL之间,表明提取的DNA质量较高,可作为分子标记的DNA模板,将DNA模板统一稀释至40 ng/μL用于研究。

注:M为2 000 bp Marker,1～14与表1样品编号相同。

2.2 ISSR引物筛选

利用100条ISSR引物对8个随机挑选的蜂糖李DNA模板进行扩增,获得在8份模板中能扩增出条带的35条ISSR引物,并对35条ISSR引物进行复筛。最终筛选出10条扩增位点清晰、可重复性好的引物,用于52份蜂糖李种质的PCR扩增。余下的ISSR引物因无法扩增出位点或者扩增出的位点不具有多肽性而被舍弃。所筛选出来的10条ISSR引物的信息详见表2,部分引物筛选的电泳结果见图2。图2中部分引物扩增出的位点出现模糊不清晰,或无扩增位点的现象,具体原因可能是设定的PCR扩增的退火温度没有达到实验引物的最适退火温度,或者是所选引物在扩增模板中的特异性较低。在后面的实验过程中,通过对试验引物进行多次的PCR扩增体系调整、优化以及对部分引物进行舍弃,可以有效避免上述情况的出现。

表2 用于供试样品鉴定的10条ISSR引物信息

2.3 ISSR标记引物多态性分析

将筛选出的10条ISSR引物分别对52份蜂糖李材料的基因组DNA进行PCR扩增实验,经脂糖电泳后,统计结果见表3。10条引物共扩增出76个位点,平均每条引物扩增7.6个,其中多态性位点有73个,平均多态性位点比率为96.05%,UBC842与UBC856扩增最多,达10个,UBC834扩增最少,仅6个。每条引物的多态性信息量在0.721 6～0.860 3之间,均值0.802 2,等位基因数在1.625 0～2.000 0之间,均值1.888 9,有效等位基因数在1.324 4～1.696 5之间,均值1.509 3,Nei"s基因多样性指数在0.221 4～0.391 6之间,均值0.300 4,Shannon"s信息指数在0.336 5～0.571 4之间,均值0.452 3。结果表明,筛选获得的10条ISSR引物的综合表现较好,适合进行蜂糖李种质亲缘关系和遗传多样性评价,能有效区分供试种质。引物UBC880、UBC899的部分电泳结果如图3所示。

注:M为2 000 bp Marker,1～24与表1编号相同。

表3 10条ISSR引物在52份蜂糖李种质的扩增结果

2.4 聚类分析

利用最终筛选出的10条核心引物,统计52份蜂糖李种质在筛选的10条ISSR引物扩增位点的数据,利用NTSYS2.10e软件计算52份蜂糖李供试种质的DICE遗传相似性系数,并对52个个体进行聚类分析(图4),以遗传相似系数0.683为阈值,52个样品可以归为3个类群,从聚类树中可知,蜂糖李第一组共15份种质,其中10份种质采自黔南州惠水县,4份采自安顺市紫云县,1份采自六马镇。第二组共17份种质,14份种质采自六马镇,2份采自息烽县,1份采自安顺市紫云县。第三组共20份种质,仅1份种质采自六马镇,其余19份种质均采自紫云县。52个蜂糖李种质间的遗传相似性系数在0.487～0.932之间,其中采自紫云县的F6种质和F7种质亲缘关系最近,相似性系数为0.932,采自惠水县的FB种质与F19种质亲缘关系最远,遗传相似系数仅为0.487。基于遗传相似性系数和聚类树状图表明,聚类结果呈现一定的地理规律性,即相同地区的大多数蜂糖李种质聚为一类,但未完全按照地理来源分类。表明52份蜂糖李种质虽然具有不同程度的亲缘关系及基因交流,但亲缘关系最近的仍是相同地区的蜂糖李。

果树类植物多为多年生植物,育种周期相对其他植物较长。因此,开展对果树类植物的种质资源遗传多样性分析显得十分重要[11]。遗传多样性,一般指的是种群之间或种群内部个体之间遗传信息的总和,能够反映出物种的遗传背景、遗传分化程度及育种潜力等,是研究物种起源与进化的重要依据,也是种质资源开发利用及保护的基础[12]。对种质的遗传多样性进行研究一直是育种工作者在研究中最为侧重的方面,也是在培育新品种过程中研究者最为关注的参考指标。ISSR分子标记技术已广泛应用于各类植物种群的遗传多样性分析[13],例如ISSR分子标记技术已应用于龙眼[14]、金花茶[15]、火龙果[16]、贵州大樱桃[17]、柑橘[18]、樱花[19]等植物的遗传多样性研究中,说明ISSR的应用已十分广泛。蜂糖李虽然是贵州的一优质李品种资源,但是关于蜂糖李资源开发利用的研究却十分罕见。因此本实验通过使用ISSR分子标记技术对蜂糖李进行遗传多样性方面的研究。

李作为销量比较大的水果之一,对于李资源的遗传多样性方面的研究十分常见。魏潇等[20]基于荧光毛细管电泳技术对17份南方品种的李种质资源进行了多样性分析,结果显示,17份李种质的平均Shannon"s多样性指数为1.709,认为供试材料具有丰富的遗传多样性。结果与王红林等[21]利用荧光毛细管电泳技术对贵州省内的16份李种质资源进行分析的结果相似(I=1.59),实验结果均明显高于本实验的结果(I=0.452 3),这可能跟二者使用的检测方法更为精密有关。陈红和杨迤然[22]通过ISSR技术研究了45份贵州当地李种质资源和3份外来引进品种的遗传多样性水平,结果显示,48份李种质资源的平均H值为0.345,平均I值为0.508,明显高于本实验(H=0.300 4,I=0.452 3)的,原因可能是其研究的对象是不同品种李的遗传多样性,本实验研究对象是单一品种。孙琪等[23]利用ISSR标记分析了30份欧李种质资源,供试单株的Nei"s遗传多样性指数为0.266 6,平均Shannon"s信息多样性指数为0.399 1,低于本研究的Nei"s遗传多样性指数值和Shannon"s信息多样性指数值,均认为这些李种具有较高的遗传多样性。目前在单一李品种内的遗传多样性研究相对较少。Basilio等[24]通过ISSR标记技术评价了29份同一品种的核心日本李种质资源的遗传多样性,结果显示,29份日本李种质资源的平均Nei"s遗传多样性指数为0.15,平均Shannon"s多样性指数为0.27;李兴婷[25]通过ISSR标记分析179份脆李,遗传特征指标如平均Nei"s基因多样性指数为0.086 6,平均Shannon"s信息指数为0.156 7;经永健[26]用ISSR分析了欧洲李种质,其中平均Nei"s基因多样性指数为0.147 0,平均Shannon"s信息指数为0.220 2。以上结果均低于本研究通过10条ISSR引物分析52份蜂糖李的结果(H=0.300 4,I=0.452 3),且均认为这些李品种遗传多样性水平较高。从侧面证明了本研究供试52份蜂糖李具有较高的遗传多样性。

多态性信息量(PIC)也是评估基因变异程度的主要指标之一[27]。本研究利用10条ISSR多态性引物对52份蜂糖李种质资源进行遗传多样性分析,PIC平均值为0.802 2,大于0.5,表明位点具有高度多态性。综合分析表明,筛选出的ISSR引物在单一品种中也具有较高水平的变异检测能力。可用于后续的蜂糖李间遗传多样性研究,为开展蜂糖李种质资源利用和保护提供分子生物学依据。

本研究对52份不同产地的蜂糖李种质资源进行了遗传多样性分析,10条引物共扩增出76个位点,其中多态性位点73个,占总位点的96.05%,引物的多态性信息量(PIC)在0.721 6～0.860 3之间,均值0.802 2,等位基因数(Na)在1.625 0～2.000 0之间,均值1.888 9,有效等位基因数(Ne)在1.324 4～1.696 5之间,均值1.509 3,Nei"s基因多样性指数(H)在0.221 4～0.391 6之间,均值0.300 4,Shannon"s信息指数(I)在0.336 5～0.571 4之间,均值0.452 3,遗传相似性系数在0.487～0.932之间,表明蜂糖李遗传信息丰富,以遗传相似系数0.683为阈值,52个样品可以归为3个类群,3个类群均未完全按照地理来源分类,但是3个类群中绝大部分种质来源于同一地区,在一定程度上体现了供试种质地理来源的相似性。综合研究结果表明,筛选出的ISSR 引物在研究蜂糖李的遗传多样性上可行的,可在分子水平上为蜂糖李种质资源的保存和利用提供参考,同时为蜂糖李优良品种选育提供科学依据。

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