梅山猪和杜洛克猪卵泡中差异表达lncRNA克隆鉴定及与miRNAs相关性分析

张化鹏，张庆泽，何凡，祁梦凡，符彬彬，李清春，李梦寻，马力鹏，刘乙，黄涛,2

梅山猪和杜洛克猪卵泡中差异表达lncRNA克隆鉴定及与miRNAs相关性分析

张化鹏1，张庆泽1，何凡1，祁梦凡1，符彬彬1，李清春1，李梦寻1，马力鹏1，刘乙1，黄涛1,2

1石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；
2新疆生猪种业工程技术研究中心，新疆昌吉 831100

【目的】通过克隆鉴定梅山猪和杜洛克猪卵泡期第4天M2卵泡中差异表达的lncRNA-ALDBSSCT0000005583，分析其在猪颗粒细胞与miRNAs表达量的相关性，为探究lncRNA调控miRNA在母猪卵泡发育过程中的作用提供理论依据。【方法】对课题组前期在梅山和杜洛克M2卵泡中筛选出的差异表达lncRNA-ALDBSSCT0000005583，进行RT-qPCR验证，并利用RACE克隆其全长序列；
根据编码潜力评估工具CPAT、CPC对该lncRNA的编码能力进行预测，原核表达试验进一步鉴定其编码能力；
核质分离试验对lncRNA-ALDBSSCT0000005583进行亚细胞定位，RT-qPCR检测其在各组织中的表达水平；
利用miRBase网站查找猪的miRNA数据库，结合RNAhybrid、miRanda在线软件预测与lncRNA-ALDBSSCT0000005583有相互作用的物种间保守miRNA，使用TargetScan和miRanda预测与lncRNA-ALDBSSCT0000005583具有相互作用miRNA的靶基因，并对其靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析；
通过过表达以及干扰lncRNA验证其对miRNA表达量的影响。【结果】lncRNA- ALDBSSCT0000005583在杜洛克猪M2卵泡中的表达量显著高于梅山猪，lncRNA 5"RACE和3"RACE片段大小为569 bp和546 bp，测序分析表明lncRNA-ALDBSSCT0000005583大小为588 bp。生物信息学预测其编码潜能较低，同时原核表达试验结果进一步证明其不编码蛋白质。组织表达谱分析表明，lncRNA-ALDBSSCT0000005583在肾上腺、脾肝和卵巢中表达量较高，在下丘脑和心脏中的表达量较低，亚细胞定位结果显示该lncRNA主要存在于细胞质中。生物信息学分析后共筛选出9个物种间保守的miRNA与lncRNA-ALDBSSCT0000005583具有潜在的相互作用，其中有两个与卵巢发育相关的miRNA：miR-193a-5p、miR-361-3p；
KEGG和GO富集分析显示miR-193a-5p、miR-361-3p的靶基因与系统进程和细胞与细胞信号传导等生物学过程有关，并显著参与到催产素、Ras、NF-κB、促性腺激素释放激素分泌等通路。随后在颗粒细胞中过表达lncRNA-ALDBSSCT0000005583，经RT-qPCR发现miR-193a-5p、miR-361-3p的表达量均显著下调（＜0.05)，但干扰lncRNA-ALDBSSCT0000005583后无显著影响。【结论】lncRNA-ALDBSSCT0000005583是一个不具备编码蛋白质能力的lncRNA，在梅山与杜洛克猪中等卵泡间表达量有极显著差异，在肾上腺、脾肝和卵巢中表达量较高，主要存在于颗粒细胞的细胞质中，可能与miR-193a-5p、miR-361-3p相互作用，从而参与猪卵巢颗粒细胞的发育过程。

lncRNA-ALDBSSCT0000005583；
猪；
卵泡；
颗粒细胞；
miR-193a-5p；
miR-361-3p

【研究意义】长链非编码RNA（long non-coding RNA lncRNA）是长度超过200个碱基的转录本，没有蛋白质编码潜能[1]。越来越多的研究表明，lncRNA参与各种重要生物过程的调控，包括染色质修饰、选择性剪接、表观遗传修饰、充当分子骨架、转录和转录后调控[2- 6]。lncRNA既可以充当竞争性内源性RNA（ceRNA），也可以“吸附”miRNA或蛋白质，调节mRNA的翻译[7]。母猪的繁殖力是养猪业的一个重要特征，梅山猪以其高繁殖力和较大的窝产仔猪数而闻名[8]。与杜洛克母猪相比，梅山母猪在卵泡期中后期可以维持较多的中型卵泡库，产生更多的排卵前卵泡，有可能排出更多的成熟卵子并生下更多的胎儿[9-10]。因此研究梅山猪和杜洛克猪M2卵泡中差异表达的lncRNA的具体功能及调控机制，对提高母猪的繁殖力具有重要意义。【前人研究进展】近年来随着高通量测序技术的发展，许多研究表明lncRNA可以调节卵泡发育，进而影响母猪的繁殖力。HU等[11]鉴定了大白母猪在发情周期的卵泡期和黄体期的繁殖力相关的卵巢lncRNA，并发现卵巢中的lncRNA显著影响猪的生育能力。LI等[10]通过转录组测序在梅山猪和杜洛克猪M2卵泡中共鉴定出3 554个lncRNA，其中与繁殖性状有关的差异表达lncRNA有127个。LIU等[12]在杜洛克猪卵泡期的第0、2和4天鉴定了猪卵巢的lncRNA和mRNA表达谱，发现lncRNA- ENSSSCT00000034907可能在卵泡发育中发挥重要作用。【本研究切入点】前人研究表明，lncRNA在猪的卵巢中发挥着重要作用，但是关于猪卵巢lncRNA的研究只集中于筛选出卵巢中差异表达的lncRNA，并未进行下一步验证。【拟解决的关键问题】本研究利用本课题组前期出在梅山和杜洛克猪M2卵泡筛选的差异表达lncRNA-ALDBSSCT0000005583进行RACE克隆，并利用生物信息学对其靶向miRNA进行预测，结合组织表达谱分析其表达量，并验证其在颗粒细胞中的亚细胞定位，从而为猪lncRNA通过miRNA发挥功能的调控机制研究提供试验依据。

试验于2022—2023年在石河子大学动物科技学院遗传育种与繁殖实验室完成。

1.1 试验材料

1.1.1 试验样品来源 2023年8月，在石河子大学附属兽医站，选取体重接近、健康大白猪三头，屠宰后采集心、胃、大脑、脾、肾上腺、肝、小肠、卵巢、子宫等组织，DEPC处理后，锡纸包裹于液氮中冻存，带回实验室备用；
梅山和杜洛克猪M2卵泡样品为石河子大学动物科技学院遗传育种与繁殖实验室保存。细胞在石河子市绿源达康屠宰场中采集的猪卵巢，经处理后冻存于液氮中的原代颗粒细胞。

1.1.2 主要试剂与仪器 主要试剂：pCDNA3.1（+）载体；
pET-28a（+）载体；
DH5α感受态细胞为实验室保留；
siRNA oligos由上海吉玛公司合成；
lipofectamine® 3000（赛默飞）；
Trizol up（全式金）；
SMARTer®RACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa）；
DAPI染色剂（碧云天）；
一抗，卵泡刺激素受体（FSHR），二抗，CY3-羊抗兔IgG；
NE-PERTM细胞核和细胞质提取试剂盒（赛默飞）等。

主要仪器：超低温冰箱（-80℃）、CO2培养箱、高压灭菌锅、LightCycle 96实时荧光定量PCR仪、高速离心机、Nano-Drop ND 2000c Spectrophotometer、荧光倒置显微镜等。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

根据TRIzolip up试剂盒说明书提取样本总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000进行总RNA的完整性和纯度检验合格后备用。

按照TaKaRa反转录试剂盒PrimeScriptTM RT ReagentKit with gDNA Eraser（PerfectＲeal Time）说明书进行cDNA合成。

1.3 荧光定量PCR和lncRNA-ALDBSSCT0000005583克隆及分析

根据实验室之前二代测序结果中lncRNA- ALDBSSCT0000005583的部分已知核苷酸序列，使用Primer Primer 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物、5′RACE和3′RACE特异性引物。实时荧光定量PCR内参基因选择GAPDH，在用于RACE克隆的特异性引物（GSP）在5′端添加15 bp“GATTACGCCAA GCTT”的序列用于后续实验中的连接测序，所有引物见表1。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 lncRNA-ALDBSSCT0000005583编码能力预测

通过编码潜力评估工具CPAT（coding-potential assessment tool）、CPC（http://lilab.research.bcm.edu/）在线预测工具对lncRNA-ALDBSSCT0000005583进行编码潜能预测。

1.5 过表达载体以及原核表达载体构建

以杜洛克猪M2卵泡cDNA为模板，扩增lncRNA全长，经2 %的琼脂糖凝胶电泳（120 V，40 min）检测后，切取目的条带，胶回收，经双酶切后与pcDNA3.1（+）载体进行连接，转化，测序。

将lncRNA-ALDBSSCT0000005583全长和YY1的CDs区亚克隆到Pet-28a（＋）载体的RⅠ和Ⅰ酶切位点上，获得lncRNA-ALDBSSCT0000005583和YY1原核表达质粒，转化至BL21(DE3)感受态细胞，获得重组质粒后进行酶切和测序鉴定。YY1为实验室保存的pcDNA3.1过表达载体，经RⅠ和Ⅰ双酶切后连接至Pet-28a（+）载体上，作为阳性对照，空载体作为阴性对照。

经测序鉴定成功的阳性菌液，37 ℃摇床200 r/min培养至OD 0.6—0.8，以Pet-YY1为阳性对照，空载体为阴性对照，各加入终浓度为1.0 mmol·L-1IPTG溶液，诱导表达4 h。取1 mL诱导后的菌液，12 000 r/min离心5 min，弃去上清，根据菌液沉淀的量，用50—100 μL PBS重悬沉淀，加入5×loading buffer上样缓冲液，金属浴中100 ℃10 min，保证菌体完全裂解，12 000 r/min离心5 min后，取10 μL用于SDS-PAGE电泳分析。SDS凝胶用考马斯亮蓝染色2 h，脱色液脱色后，在凝胶成像系统上观察结果。

1.6 猪颗粒细胞培养与鉴定

常规的细胞复苏，向复苏的细胞中加入10 mL完全培养基（DMEM，FBS，双抗）轻柔吹匀，根据细胞密度合理铺入6孔板中。将铺好的细胞于37 ℃、5% CO2培养箱中，培养细胞，48 h后使用PBS清洗颗粒细胞。运用免疫荧光的方法检测细胞中卵泡刺激素受体（FSHR），以鉴定颗粒细胞。

1.7 lncRNA亚细胞定位

试验采用猪颗粒细胞，按照NE-PER™ 细胞核和细胞质提取试剂盒说明书进行细胞核细胞质RNA分离，通过qPCR检测lncRNA-ALDBSSCT0000005583在猪颗粒细胞细胞核细胞质中的表达量。

1.8 颗粒细胞转染及收集

6孔板培养颗粒细胞待融合度达到70%—90%时，使用Lipofectamine® 3000试剂盒将过表达载体pCDNA3.1-lncRNA-ALDBSSCT0000005583以及siRNA- ALDBSSCT0000005583转染至猪颗粒细胞，以空质粒pCDNA3.1及siRNA-NC作为对照。利用RT-qPCR检测转染处理48 h后的过表达/抑制的效率。

1.9 lncRNA-ALDBSSCT0000005583-miRNA靶基因预测

从miRBase（https://www.mirbase.org）获得了猪的成熟miRNA序列，利用RNAhybrid（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid）和miRanda（https://www.miranda-ng.org/en/）分别预测与lncRNA- ALDBSSCT0000005583存在相互作用的miRNA。对两款软件预测出的miRNA分别按照每款软件的评分标准进行筛选，取两款软件的交集作为最终的miRNA。使用TargetScan（v5.0）、miRanda（v3.3a）对筛选出的miRNA分别进行靶基因预测。利用KEGG和GO数据库进行富集分析，用Cytoscape 3.6.0软件构建候选miRNA-mRNA相互作用的结果图。

表1 RT-qPCR及载体构建引物序列

F：上游引物；
R：下游引物。表中加粗部分为保护碱基；
下划线部分为酶切位点；
酶切位点为R Ⅰ和Ⅰ；
波浪线部分为添加的序列，用于后续试验中的无缝克隆。lncRNA-5583为lncRNA-ALDBSSCT0000005583缩写，下同

F: Upstream primers; R: Downstream primers. The bold part in the table is the protective base; The underlined part is the enzyme cleavage site; The digestion sites wereR I. andI. The wavy portion is the added sequence for seamless cloning in subsequent experiments. lncRNA-5583 is an abbreviation for lncRNA-ALDBSSCT0000005583, The same as below

1.10 数据分析

实时荧光定量PCR以GAPDH作为内参，RT-qPCR结果按使用2-ΔΔct法计算，用SPSS17.0软件进行显著性分析。以GAPDH基因作为内参基因对检测的目的基因进行归一化，U6作为细胞核基因内参。数据使用 Graph Pad Prism 8 进行作图，其中“*”（＜0.05）为差异显著，“**”（＜0.01）为差异极显著，“ns”（＞0.05）表示差异不显著。所有引物见表1。

2.1 lncRNA-ALDBSSCT0000005583在M2卵泡中的表达分析

通过qRT-PCR技术对lncRNA-ALDBSSCT0000005583在梅山猪和杜洛克猪的M2卵泡的表达情况进行验证分析发现，lncRNA-ALDBSSCT0000005583在杜洛克猪M2卵泡中的表达量极显著高于梅山猪，结果与二代测序的结果相同（＜0.01）（图1），表明了二代测序结果的可靠性。

A：二代测序结果ALDBSSCT0000005583在M2卵泡中的表达水平；
B：RT-qPCR验证ALDBSSCT0000005583的表达水平

2.2 lncRNA-ALDBSSCT0000005583序列特征

根据SMARTer RACE 5"3" Kit 扩增猪长链非编码lncRNA-ALDBSSCT0000005583，结果表明，3′RACE片段大小为546 bp（图2-A），5′RACE片段大小为569 bp（图2-B），根据3′RACE和5′ RACE测序序列结果拼接确定lncRNA-ALDBSSCT0000005583全长为588 bp（图2-C）。

2.3 lncRNA-ALDBSSCT0000005583的鉴定

利用在线软件CPAT和CPC对长链非编码RNA lncRNA-ALDBSSCT0000005583的编码能力进行分析计算，结果lncRNA-ALDBSSCT0000005583的编码能力分别为0.0122981（表2）、0.01716（表3），属于非编码RNA。

为了进一步验证lncRNA-ALDBSSCT0000005583是否具有编码能力，成功构建了pET-28a-lncRNA- ALDBSSCT0000005583（图3-A）、pET-28a-YY1（图3-B）原核表达载体，通过原核表达试验发现lncRNA- ALDBSSCT0000005583与pET-28a（+）空质粒的电泳条带一致，而相同试验条件下阳性对照pET- 28a-YY1则在69 kDa处有明显的新增条带（图3-C）。综合以上研究结果强调lncRNA-ALDBSSCT0000005583是一种真正的非编码RNA。

表2 CPAT网站预测编码潜能

表3 CPC网站预测编码潜能的结果

2.4 颗粒细胞鉴定及lncRNA亚细胞定位

颗粒细胞的鉴定结果如图4所示，鉴于FSHR是卵巢中唯一表达FSHR的细胞，通过检测细胞中FSHR的表达情况判断是否是颗粒细胞，免疫荧光结果显示，培养的细胞中FSHR阳性率较高，判断培养的细胞为颗粒细胞，可以用于进行下一步试验。

利用猪的颗粒细胞进行核质分离试验，确定了lncRNA-ALDBSSCT0000005583的亚细胞定位，结果显示，lncRNA-ALDBSSCT0000005583主要存在于细胞质中（图5）。

2.5 lncRNA-ALDBSSCT0000005583组织表达谱

试验利用RT-qPCR技术，探究lncRNA- ALDBSSCT0000005583在猪不同组织中的表达情况。组织表达谱结果显示，lncRNA-ALDBSSCT0000005583在心、下丘脑、胃、卵巢、脾、肾上腺、肝、小肠、子宫中均有不同程度表达，在肾上腺、脾、肝和卵巢中表达量较高，在下丘脑和心中的表达量较低（图6），以上研究表明lncRNA-ALDBSSCT0000005583在这些组织中可能均具备生物学功能。

2.6 lncRNA-ALDBSSCT0000005583生物信息学分析

根据miRbase 22数据库，下载猪的所有miRNAs，利用RNAhybrid和miRanda在线软件分析与lncRNA-ALDBSSCT0000005583具有相互作用的miRNA，共发现9个在人、小鼠、大鼠、牛、猪等物种之间保守的miRNAs（图7），利用TargetScan（v5.0）、miRanda（v3.3a）对这9个miRNA筛选出7 963个潜在的靶基因，借助Cytoscape软件构建了lncRNA- miRNA-mRNA靶向关系的网络构建图（图8）。

A：lncRNA- ALDBSSCT0000005583全长扩增和连接至pET-28a（+）载体Sanger DNA测序；
B：pET-28a-YY1双酶切结果及Sanger DNA测序；
C：SDS-PAGE电泳分析

图4 颗粒细胞的鉴定

查阅文献发现miR-193a-5p[13]、miR-361-3p[14]可能与卵巢的发育有关。根据TargetScan（v5.0）和miRanda（v3.3a）分别对miR-193a-5p、miR-361-3p筛选出1 152、3 026个潜在的靶基因，对这两个miRNA的靶基因求交集共获得298个靶基因。对这些靶基因进行GO富集分析和KEGG信号通路分析，结果表明，这些miRNAs显著富集到系统进程和细胞与细胞信号传导等生物学过程中（表4）。KEGG信号通路分析表明，这两个miRNA显著参与到催产素信号通路、Ras信号通路、NF-κB信号通路、促性腺激素释放激素分泌通路等（表5）。

图5 lncRNA- ALDBSSCT0000005583亚细胞定位

2.7 lncRNA-miRNA表达相关性分析

过表达lncRNA-ALDBSSCT0000005583有显著的过表达效果（图9-A），siRNA-ALDBSSCT0000005583有极显著的抑制效果（图9-B），结果表明过表达以及干扰lncRNA-ALDBSSCT0000005583的猪卵巢颗粒细胞模型构建成功，可以进行下一步试验。

图6 lncRNA-ALDBSSCT0000005583在杜洛克猪不同组织中的表达情况

图7 RNAhybrid和miRanda预测miRNA靶向lncRNA-ALDBSSCT0000005583

图8 lncRNA-miRNA-mRNA网络构建

表4 与lncRNA-ALDBSSCT0000005583相互作用的miRNAs靶基因的GO富集条目

过表达lncRNA后显著降低了miR-193a-5p和miR-361-3p的表达量（图9-C、E），但干扰lncRNA后miR-193a-5p和miR-361-3p的表达量有升高的趋势但不显著（图9-D、F），以上研究表明，lncRNA- ALDBSSCT0000005583在猪的卵巢颗粒细胞中可能通过调控miR-193a-5p、miR-361-3p基因的表达，从而参与卵泡的发育过程。

3.1 lncRNA-ALDBSSCT0000005583组织表达分析

母猪生产力作为影响生产效率的最重要因素之一，限制窝产仔猪数的主要因素是排卵率，排卵率越高，产仔数越多[12,15]。相对于杜洛克母猪，梅山猪的产仔数更大，以其高繁殖力闻名[16]。相关研究发现，多产的梅山母猪和杂种大白母猪在卵泡期的中后期存在卵泡生长动力学差异，这种差异极大地促进了排卵率[17]。此外，另一项研究表明，梅山母猪和杜洛克母猪在中等大小卵巢卵泡生长调节和生理发育方面也存在显著差异[18]。目前在动物卵巢中的功能和分子机制的研究发现lncRNA对卵泡的生长发育至关重要。但是关于猪卵巢lncRNA的研究主要集中于筛选出卵巢中差异表达的lncRNA，并未进行下一步验证。因此本研究通过RACE技术获取并鉴定了梅山猪和杜洛克猪M2卵泡中差异表达的lncRNA-ALDBSSCT0000005583，其全长588 bp，经原核表达试验验证，lncRNA-ALDBSSCT0000005583不具备编码蛋白的能力，是一个真正的长链非编码RNA。中枢神经系统中的神经元对肾上腺和卵巢具有跨神经支配[19]，并且在母羊卵巢摘除后，其肾周围脂肪组织中生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）表达量增加[20]。根据前人研究结果发现肾上腺和卵巢之间存在密不可分的关系。本研究通过组织表达谱分析，发现lncRNA在肾上腺中表达量最高，其次为肝、脾和卵巢，表明lncRNA-ALDBSSCT0000005583在这些组织中可能均具备生物学功能。

表5 与lncRNA-ALDBSSCT0000005583相互作用的miRNAs靶基因的信号通路

A. 过表达lncRNA-ALDBSSCT0000005583效率检测；
B. siRNA-ALDBSSCT0000005583效率检测；
C. 过表达lncRNA-ALDBSSCT0000005583对miR-193a-5p的影响；
D. 过表达lncRNA- ALDBSSCT0000005583对miR-193a-5p的影响；
E. 干扰lncRNA-ALDBSSCT0000005583对miR-361-3p的影响；
F. 干扰lncRNA- ALDBSSCT0000005583对miR-1361-3p的影响

3.2 lncRNA-ALDBSSCT0000005583-miRNA-mRNA网络分析

miRNA和lncRNA通过识别序列相互作用，其中lncRNA充当竞争性内源RNA（ceRNA）导致miRNA的隔离，并抑制miRNA对靶mRNA的调节作用[21-22]。ceRNA机制通常发生在细胞质中，这与miRNA在细胞质中起作用的观点一致[23]。本研究通过核质分离试验分析了lncRNA-ALDBSSCT0000005583的细胞定位，发现lncRNA主要存在于细胞质中，为了研究lncRNA-ALDBSSCT0000005583是否可以作为ceRNA或miRNA的海绵发挥作用，我们使用生物信息学靶基因预测工具搜索了可以与lncRNA结合的miRNA，总共筛选到9个与lncRNA相互作用的miRNAs。其中，有研究表明miR-193a-5p可以调控RAB11A[13]、HOXA7[24]和CDK14[25]抑制卵巢癌细胞的增殖并促进其凋亡；
miR-361-3p可以抑制卵泡刺激素（FSH）的分泌[14]，并且miR-361-3p也可以作为LncRNA-BBOX1-AS1[26]、LINC00922[27]的海绵对卵巢的生长发育起到一定的调控作用。结合前人对miRNAs功能的研究筛选出两个与卵巢发育相关的miRNA：miR-193a-5p和miR-361-3p。对这两个miRNAs的靶基因通过GO富集和KEGG信号通路表明：这些miRNAs显著富集到系统进程和细胞与细胞信号传导等生物学过程中。KEGG信号通路分析表明，这两个miRNA显著参与到催产素信号通路、Ras信号通路、NF-κB信号通路等。

3.3 lncRNA-ALDBSSCT0000005583与miRNA相关性分析

众所周知，miRNA通过与靶mRNA的3′-非翻译区（3′UTR）结合，成为基因调控的主要参与者，随后引起mRNA降解或翻译抑制[28]，miRNA也对卵泡发育具有一定的影响[29]。与miRNA结合的lncRNA具有极大的研究价值，因为它们可用于调控miRNA功能。到目前为止，只有少数lncRNA被发现与miRNA结合，这些lncRNA已经过验证。例如，lncRNA-ZFAS1与miR-129结合进而影响卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡[30]，lncRNA-NEAT1可以阻止miR-16、miR-483和miR-324-3p的表达来促进卵巢颗粒细胞的增殖并阻止细胞凋亡[31]，lncRNA-2300通过抑制miR-365-3p的促凋亡作用来减少猪颗粒细胞的凋亡[32]，lncRNA- FDNCR靶向湖羊的miR-543-3p来促进颗粒细胞凋亡[33]，lncRNA-MEG3通过负反馈调控miR-23影响卵泡颗粒细胞的凋亡[34]。根据ceRNA假说，lncRNA应与miRNA表达呈负相关，lncRNA下调miRNA的表达水平，降低其对mRNA的抑制作用[35]。本研究通过过表达以及干扰lncRNA发现miR-193a-5p和miR- 361-3p的表达与lncRNA存在着显著的负相关。由此可以推测，lncRNA可能调控miR-193a-5p、miR-361-3p参与到卵巢的生长发育，但是其具体的作用机制还需进一步后续验证。

lncRNA-ALDBSSCT0000005583在杜洛克猪M2卵泡中的表达量极显著高于梅山猪，是一个全长588 bp的不具有翻译蛋白质功能的lncRNA，生物信息学分析发现lncRNA-ALDBSSCT0000005583可能与系统进程和细胞与细胞信号传导等生物学过程有关；
并参与到催产素、Ras、NF-κB、促性腺激素释放激素分泌通路等通路；
并且可能对miR-193a-5p、miR-361-3p的表达存在影响。本研究为进一步探索lncRNA- ALDBSSCT0000005583在猪卵巢的生长发育过程中提供了基础数据。

[1] GOLICZ A A, BHALLA P L, SINGH M B. lncRNAs in plant and animal sexual reproduction. Trends in Plant Science, 2018, 23(3): 195-205.

[2] KHALIL A M, GUTTMAN M, HUARTE M, GARBER M, RAJ A, RIVEA MORALES D, THOMAS K, PRESSER A, BERNSTEIN B E, VAN OUDENAARDEN A, REGEV A, LANDER E S, RINN J L. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(28): 11667-11672.

[3] LEE J T. Epigenetic regulation by long noncoding RNAs. Science, 2012, 338(6113): 1435-1439.

[4] TSAI M C, MANOR O, WAN Y, MOSAMMAPARAST N, WANG J K, LAN F, SHI Y, SEGAL E, CHANG H Y. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science, 2010, 329(5992): 689-693.

[5] RINN J L, CHANG H Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annual Review of Biochemistry, 2012, 81: 145-166.

[6] HU S S, WANG X L, SHAN G. Insertion of an Alu element in a lncRNA leads to primate-specific modulation of alternative splicing. Nature Structural & Molecular Biology, 2016, 23: 1011-1019.

[7] LIU S J, DANG H X, LIM D A, FENG F Y, MAHER C A. Long noncoding RNAs in cancer metastasis. Nature Reviews Cancer, 2021, 21(7): 446-460.

[8] YOUNG L D. Effects of Duroc, Meishan, Fengjing, and Minzhu boars on productivity of mates and growth of first-cross progeny. Journal of Animal Science, 1992, 70(7): 2020-2029.

[9] FOXCROFT G R, HUNTER M G. Basic physiology of follicular maturationin the pig. Journal of Reproduction and Fertility, 1985, (Suppl 33): 1-19.

[10] LI M X, LIU Y, XIE S, MA L P, ZHAO Z C, GONG H B, SUN Y S, HUANG T. Transcriptome analysis reveals that long noncoding RNAs contribute to developmental differences between medium-sized ovarian follicles of Meishan and Duroc sows. Scientific Reports, 2021, 11: 22510.

[11] HU H Y, JIA Q, XI J Z, ZHOU B, LI Z Q. Integrated analysis of lncRNA, miRNA and mRNA reveals novel insights into the fertility regulation of large white sows. BMC Genomics, 2020, 21(1): 636.

[12] LIU Y, LI M X, BO X W, LI T, MA L P, ZHAI T, HUANG T. Systematic analysis of long non-coding RNAs and mRNAs in the ovaries of duroc pigs during different follicular stages using RNA sequencing. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(6): 1722.

[13] WANG Y Z, LI N, ZHAO J, DAI C W. MiR-193a-5p serves as an inhibitor in ovarian cancer cells through RAB11A. Reproductive Toxicology, 2022, 110: 105-112.

[14] YE R S, LI M, LI C Y, QI Q E, CHEN T, CHENG X, WANG S B, SHU G, WANG L N, ZHU X T, JIANG Q Y, XI Q Y, ZHANG Y L. MiR-361-3p regulates FSH by targeting FSHB in a porcine anterior pituitary cell model. Reproduction, 2017, 153(3): 341-349.

[15] LIU J Y, QI N N, XING W W, LI M X, QIAN Y H, LUO G, YU S L. The TGF-β/SMAD signaling pathway prevents follicular atresia by upregulating MORC2. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(18): 10657.

[16] ZHENG X R, ZHAO P J, YANG K J, NING C, WANG H F, ZHOU L, LIU J F. CNV analysis of Meishan pig by next-generation sequencing and effects ofgene CNV on pig reproductive traits. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2020, 11: 42.

[17] MILLER A T, PICTON H M, CRAIGON J, HUNTER M G. Follicle dynamics and aromatase activity in high-ovulating Meishan sows and in large-white hybrid contemporaries. Biology of Reproduction, 1998, 58(6): 1372-1378.

[18] MA L P, ZHAO Z C, LI T, LI D Q, WANG X Y, SONG C Y, QI Y Y, HUANG T. Identification of differentially expressed microRNAs in middle-size ovarian follicles of Meishan and Duroc sows. Revista Brasileira De Zootecnia, 2019, 48. doi:10.1590/rbz4820170326.

[19] TÓTH I E, BANCZEROWSKI P, BOLDOGKŐI Z, TÓTH J S, SZABÓ A, HALÁSZ B, GERENDAI I. Cerebral neurons involved in the innervation of both the adrenal gland and the ovary: a double viral tracing study. Brain Research Bulletin, 2008, 77(5): 306-311.

[20] 张磊, 王燕燕, 周占琴, 李广, 付明哲, 张锁良, 尹海科, 张胜刚, 任宝华. 卵巢摘除对山羊血清GH水平和组织中GHR基因表达的影响. 中国农业科学, 2014, 47(1): 199-208. doi: 10.3864/j.issn.0578- 1752.2014.10.003.

ZHANG L, WANG Y Y, ZHOU Z Q, LI G, FU M Z, ZHANG S L, YIN H K, ZHANG S G, REN B H. Effects of ovariectomy on serum GH levels and expression of GHR in some tissues of female goats. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(1): 199-208. doi: 10.3864/j.issn. 0578-1752.2014.10.003.(in Chinese)

[21] HAN T S, HUR K, CHO H S, BAN H S. Epigenetic associations between lncRNA/circRNA and miRNA in hepatocellular carcinoma. Cancers, 2020, 12(9): 2622.

[22] WANG H, HUO X S, YANG X R, HE J, CHENG L J, WANG N, DENG X, JIN H J, WANG N, WANG C, ZHAO F Y, FANG J Y, YAO M, FAN J, QIN W X. STAT3-mediated upregulation of lncRNA HOXD-AS1 as a ceRNA facilitates liver cancer metastasis by regulating SOX4. Molecular Cancer, 2017, 16(1): 136.

[23] HUARTE M. The emerging role of lncRNAs in cancer. Nature Medicine, 2015, 21: 1253-1261.

[24] WANG S, DIAO Y J, ZHU B B. MiR-193a-5p suppresses cell proliferation and induces cell apoptosis by regulating HOXA7 in human ovarian cancer. Neoplasma, 2020, 67(4): 825-833.

[25] 杨尊敬, 杜先玲. 细胞周期蛋白依赖性激酶在miR-193a5p调控卵巢癌细胞增殖及上皮细胞间充质转变中的作用. 中国应用生理学杂志, 2020, 36(2): 176-180.

YANG Z J, DU X L. The role of cyclin-dependent kinases in miR-193a5p regulating ovarian cancer cell proliferation and epithelial mesenchymal transformation. Chinese Journal of Applied Physiology, 2020, 36(2): 176-180. (in Chinese)

[26] YAO H P, CHEN R, YANG Y X, JIANG J. LncRNA BBOX1-AS1 aggravates the development of ovarian cancer by sequestering miR-361-3p to augment PODXL expression. Reproductive Sciences, 2021, 28(3): 736-744.

[27] WANG L P, REN C C, XU Y J, YANG L, CHEN Y N, ZHU Y H. The LINC00922 aggravates ovarian cancer progression via sponging miR-361-3p. Journal of Ovarian Research, 2021, 14(1): 77.

[28] BARTEL D P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell, 2009, 136(2): 215-233.

[29] 陈慧芳, 黄绮亮, 胡智超, 潘晓婷, 吴志胜, 白银山. 外泌体microRNA在猪成熟和闭锁卵泡中的表达差异及功能分析. 中国农业科学, 2021, 54(21): 4664-4676. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752. 2021.21.015.

CHEN H F, HUANG Q L, HU Z C, PAN X T, WU Z S, BAI Y S. Expression differences and functional analysis of exosomes microRNA in porcine mature and atretic follicles. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(21): 4664-4676. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.015.(in Chinese)

[30] ZHU H L, CHEN Y Q, ZHANG Z F. Downregulation of lncRNA ZFAS1 and upregulation of microRNA-129 repress endocrine disturbance, increase proliferation and inhibit apoptosis of ovarian granulosa cells in polycystic ovarian syndrome by downregulating HMGB1. Genomics, 2020, 112(5): 3597-3608.

[31] Sang X , Zhang Y Z. Withdrawal: “long non-coding RNA NEAT1 drives the development of polycystic ovary syndrome via sponging multiple microRNAs” by Xia Sang and Yuzhen Zhang. Cell Biology International, 2022, 46(7): 1175.

[32] WANG M M, WANG Y, YAO W, DU X, LI Q F. Lnc2300 is a cis-acting long noncoding RNA of CYP11A1 in ovarian granulosa cells. Journal of Cellular Physiology, 2022, 237(11): 4238-4250.

[33] YAO X L, GAO X X, BAO Y J, EL-SAMAHY M A, YANG J Y, WANG Z B, LI X D, ZHANG G M, ZHANG Y L, LIU W J, WANG F. lncRNApromotes apoptosis of granulosa cells by targeting the miR-543-3p/DCN/TGF-β signaling pathway in Hu sheep. Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2021, 24: 223-240.

[34] HAN X H, PAN Y Y, FAN J F, WANG M, WANG L B, WANG J L, AFEDO S Y, ZHAO L, WANG Y Y, ZHAO T, ZHANG T X, ZHANG R, CUI Y, YU S J.regulatesaxis-mediated apoptosis and autophagy via spongingin granulosa cells of yak tertiary follicles. Cellular Signalling, 2023, 107: 110680.

[35] TANG Y L, ZHANG H, CHEN L L, ZHANG T M, XU N, HUANG Z N. Identification of hypoxia-related prognostic signature and competing endogenous RNA regulatory axes in hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(21): 13590.

Cloning and Identification of Differentially Expressed lncRNAs in Follicles of Meishan Pigs and Duroc Pigs with Their Correlation Analysis with miRNAs

ZHANG HuaPeng1, ZHANG QingZe1, HE Fan1, QI MengFan1, FU BinBin1, LI QingChun1, LI MengXun1, MA LiPeng1, LIU Yi1, HUANG Tao1, 2

1College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang;2Xinjiang Pig Seed Industry Engineering Technology Research Center, Changji 831100, Xinjiang

【Objective】 The objective of this study was to clone and identify the differentially expressed lncRNA-ALDBSSCT0000005583in M2 follicles on the fourth day of follicular stage in Meishan pigs and Duroc pigs, and to analyze the correlation between the expression of miRNAs in porcine granulosa cells, so as to provide a theoretical basis for exploring the role of lncRNAs in the development of follicles in sows by regulating miRNAs. 【Method】Based on the differentially expressed lncRNA- ALDBSSCT0000005583 screened in Meishan and Duroc M2 follicles in our early research, the full-length sequence of ALDBSSCT0000005583 was verified by RT-qPCR and cloned by RACE; the coding ability of this lncRNA was predicted by the coding potential assessment tool of CAPT and CPC, which was further identified by the primary expression test; the coding ability of this lncRNA was identified by the primary expression test; the subcellular coding ability of NA-ALDBSSCT0000005583 was identified by the nucleoplasmic separation experiment and tested to identify its coding ability; the subcellular localization of lncRNA-ALDBSSCT0000005583 by nucleoplasmic isolation assay and its expression level in various tissues were detected by RT-qPCR; miRBase website was used to locate the miRNA database of pigs, and the combination of RNAhybrid and miRanda online software was used to predicte the relationship with the lncRNA-ALDBSSCT0000005583. The inter-species conserved miRNAs that interacted with lncRNA-ALDBSSCT0000005583 were predicted by TargetScan and miRanda, the target genes that interacted with lncRNA-ALDBSSCT0000005583 were predicted by TargetScan and miRanda, and their target genes were subjected to GO enrichment and KEGG signaling pathway analyses; the effects of target genes on miRNA expression were verified by overexpression as well as interference with lncRNA. 【Result】The expression level of lncRNA-ALDBSSCT0000005583 in M2 follicles of Duroc pigs was significantly higher than that in Meishan pigs, and the size of lncRNA 5′RACE and 3′RACE fragments was 569 bp and 546 bp, respectively, and the sequencing analysis showed that the size of lncRNA-ALDBSSCT0000005583 was 588 bp. Bioinformatics predicted that the encoding potential was low, and the results of prokaryotic expression assay further proved that it did not code for proteins. Tissue expression profiling showed that lncRNA-ALDBSSCT0000005583 was expressed in the adrenal gland, spleen, liver and ovaries, and low in the hypothalamus and heart, while the subcellular localization results showed that the lncRNA was mainly present in the cytoplasm. After bioinformatics analysis, a total of 9 conserved miRNAs were screened for potential interaction with lncRNA-ALDBSSCT0000005583, including two miRNAs related to ovarian development: miR-193a-5p and miR-361-3p. KEGG and GO enrichment analysis showed that the target genes of miR-193a-5p and miR-361-3p were related to phylogenetic processes and biological processes such as cell-to-cell signaling. It was also significantly involved in oxytocin, Ras, NF-κB gonadotropin- releasing hormone secretion and other pathways. Subsequently, lncRNA-ALDBSSCT0000005583 was overexpressed in granulosa cells, and the expressions of miR-193a-5p and miR-361-3p were significantly down-regulated by RT-qPCR (＜0.05), but there was no significant effect after interference with lncRNA-ALDBSSCT0000005583. 【Conclusion】lncRNA-ALDBSSCT0000005583 was a lncRNA that did not have the ability to code for proteins. There was a significant difference in the expression level between the medium follicles of Meishan and Duroc pigs, and the expression level was higher in the adrenal glands, spleen, liver and ovaries, which is mainly found in the cytoplasm of granulosa cells, and might be involved in the development of porcine ovarian granulosa cells by interacting with miR-193a-5p and miR-361-3p.

lncRNA-ALDBSSCT0000005583; pig; follicle; granulosa cells; miR-193a-5p; miR-361-3p

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.09.014

2023-11-06；

2024-01-11

国家自然科学基金（31960645）、新疆维吾尔自治区天山英才青年科技拔尖人才项目（2022TSYCCX0047）、新疆维吾尔自治区第七师胡杨河市“揭榜挂帅”项目（QS2023010）

张化鹏，E-mail：914566978@qq.com。通信作者黄涛，E-mail：taohuang100@sina.com

（责任编辑 林鉴非）

猜你喜欢 杜洛克梅山颗粒细胞 MicroRNA调控卵巢颗粒细胞功能的研究进展中国计划生育和妇产科(2021年9期)2021-04-18《全国优秀公猪站》手册（二）猪业科学(2020年5期)2020-12-11《全国优秀公猪站》手册（一）猪业科学(2020年4期)2020-05-11大腿肌内颗粒细胞瘤1例中国临床医学影像杂志(2019年6期)2019-08-27梅山黄河之声(2019年1期)2019-03-30游梅山龙宫少儿美术(快乐历史地理)(2018年4期)2018-09-25杜洛克与纳雍糯谷猪杂交母系选育效果观察猪业科学(2018年5期)2018-07-17梅山情黄河之声(2018年6期)2018-05-18补肾活血方对卵巢早衰小鼠颗粒细胞TGF-β1TGF-βRⅡ、Smad2/3表达的影响中成药(2017年9期)2017-12-19选购杜洛克种公猪要“八看”科学种养(2014年10期)2014-10-23