黑米色素抗氧化性能研究

吴娟　曾旭诺　叶利利

摘要 研究了黑米色素提取最佳工艺参数及抗氧化性能，结果显示：在对黑米色素进行提取的过程中，当料液比达到1∶6，提取30 min时，提取效果最好。黑米色素对DPPH自由基、超氧阴离子、羟基自由基都有一定清除能力，为黑米色素在食品和生物医药等多个领域的广泛应用和研究提供一定的理论基础。

关键词 黑米色素；
提取工艺；
色素提取率；
抗氧化性能；
自由基

中图分类号 TS 201.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2023）15-0147-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.036

Study on Antioxidant Activity of Black Rice Pigment

WU Juan， ZENG Xu-nuo， YE Li-li

（School of Life Sciences， Anqing Normal University， Anqing， Anhui 246133）

Abstract The best technological parameters and antioxidant properties of black rice pigment were studied. The results showed that in the process of extracting black rice pigment， when the solid-liquid ratio reached 1∶6 and the extraction duration was about 30 min， the extraction effect could reach the best. Black rice pigment can scavenge DPPH radical， superoxide anion and hydroxyl radical， which provides a theoretical basis for the wide application and research of black rice pigment in food， biomedicine and other fields.

Key words Black rice pigment;Extraction process;Pigment extraction rate;Oxidation resistance;Free radical

黑米（Nigrum rice）是由禾本科植物稻谷经长期培育形成的一类药食兼用的大米。现代医学也证实黑米具有益气补肾、健脾益肝、养精蓄锐的功效，可改善视力及促进血液循环［1］。黑米色素属于黄酮花色素苷类，主要来源于黑紫色稻谷种皮中，主要成分包括甲基花青定葡萄糖苷（13%）、花青定-3-鼠李葡萄糖苷、花青定-3-葡萄糖苷（75%）等。它们大部分都是以与其他糖类相互结合的形式存在，其主要性质之一是可溶于纯水，呈淡红色或紫色，可广泛应用于食品、医药及美妆等行业［2］。黑米色素在苷类分子结构中含有酚羟基，因此具有特殊的抗氧化性能。结构决定性质，正是由于这些酚羟基可以与暂存性自由基结合，生成稳定的自由基，螯合启动脂质过氧化的金属离子，参与抗氧化的协同作用，通过终止自由基链式反应，螯合金属离子，清除活性氧，从而减少自由基对人体的侵害作用［3-4］。

近些年，黑米色素逐渐进入人们的视野，不仅色素提取工艺越来越精湛，还对于黑米色素功效的研究也逐渐深入，特别是对其抗氧化方面的研究较多。据孙玲等［5］对黑米色素的研究发现，黑米色素在体外模拟试验中证明其对人体也有一定的功效。试验证明，黑米色素对自由基的去除能力与其浓度成正比，即浓度越高，在体外对自由基的去除能力越强。张名位等［6］研究发现，黑米花色苷对人体的肝脏有一定影响。通过对黑米花色苷在体内的研究证明，在摄入黑米花色苷后，肝脏的抗氧化能力有所增强，身体内部分过氧化氢物分解酶的活力也得到了提高。李新华等［7］研究发现，黑米色素对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子均具有很好的去除效果，还将其与标准抗氧化剂VC进行了系统的对比。王巧娥等［8］运用纯化植物的方法进行了对比研究，发现黑米花色苷在植物不同部位纯化提取其抗氧化活性不同，可溶于水部分的黑米花色苷的抗氧化活性高于其他部分。以上研究都证实了黑米色素具有较良好的抗氧化性，可以作为较理想的氧化剂材料应用于多个领域［9］。

从黑米中提取出的黑米色素不仅对人体安全无害，还具有较高的营养价值，在药理上也有很大作用，对人体健康也起到较大作用。由于黑米色素对人体的安全特性，被广泛应用于食品方面。黑米色素能够运用于食品防腐，从而代替一些化工合成的化学防腐剂，也可运用于食品和饮品的染色，代替一些化学食品染色剂［10］。黑米色素的资源丰富，而且具有天然健康的特性，符合现代人们对食品健康的期待，在食品方面有较强的运用前景。笔者研究了黑米色素的提取工艺及黑米色素抗氧化性能，以期为开发利用具有抗氧化性能的黑米天然食用色素提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料为市售膳食黑米，提取试剂为无水乙醇与乙酸。分析试剂为标准抗氧化剂VC、Tris-HCl、鄰苯三酚、DPPH、无水乙醇、1，10-菲啰啉、过氧化氢、硫酸亚铁、捣碎机、分光光度计、离心机、电子天平、水浴锅等。

1.2 黑米色素提取方法

先将黑米粉碎后过50目筛得到干粉状黑米粉，将得到的黑米粉放置于棕色试剂瓶中避光保存，然后将浸提剂无水乙醇与干粉状黑米粉按照比例混合，并在水浴锅中浸提一段时间后取出上清液于4 ℃4 000 r/min离心将杂质沉淀，经减压过滤得到色素的浸提液，将其进行浓缩除去浸提液，得到黑米色素浓缩液，冷藏避光保存。

1.3 试验设计

料液比对黑米色素提取率的影响试验设计：黑米粉10  g，按照1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12料液比加入无水乙醇，在水浴中浸提一定时间后测定吸光值。

提取时间对黑米色素提取率的影响试验设计：黑米粉10 g，按照一定料液比加入无水乙醇，在30 ℃水浴中分别连续浸提10、20、30、40、50、60 min后再测定吸光值。

1.4 抗氧化性测定

1.4.1 黑米色素DPPH自由基清除能力测定。

先测定2 mL DPPH的无水乙醇溶液在517 nm处的吸光值（A1），再加入2 mL不同浓度梯度的待测黑米色素溶液，混合均匀。放置于避光环境反应30 min，再于517 nm处测其吸光值，所得数据即可作为样品的吸光值（A2）。将2 mL蒸馏水代替上述试验操作中的黑米色素样品，重复上述操作，即可得到空白吸光度值（A0）。将标准抗氧化剂VC的清除能力作为对照，进行相同的试验操作。待测样品对DPPH自由基的抑制率按下式计算：

清除率=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

1.4.2 黑米色素超氧阴离子清除能力测定。

在25 ℃恒温水浴锅中，将4 mL 0.05 mol/L、pH为8.2、预热20 min的Tris-HCl缓冲液加入10 mL比色管中，加入25 ℃预热20 min 1 mL蒸馏水作为空白对照组，再加入1 mL 25 ℃预热20 min的0.2 mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05 mol/L盐酸配制），并迅速地摇匀，于25 ℃ 325 nm吸光值下每隔30 s測定1次。邻苯三酚自氧化反应4 min后，加2滴浓度为8 mol/L盐酸混匀，使其完全终止氧化反应，测得吸光值（A0）。接着分别用1 mL不同浓度梯度的黑米色素待测样品代替蒸馏水，测得吸光值为A1，以标准抗氧化剂VC作为对照，重复上述操作测得吸光值。待测样品对邻苯三酚自氧化的抑制率按下式计算：

清除率=（A0-A1）/A0×100%

1.4.3 黑米色素羟基自由基清除能力测定。

向含有试管塞的试管中倒入1 mL硫酸亚铁溶液与2 mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，充分混合均匀，然后依次加入1 mL 1，10-菲啰啉与1 mL 0.01%过氧化氢溶液，于37 ℃水浴60 min后在536 nm处检测吸光值，为损伤的吸光度（A损）。以1 mL不同浓度梯度的黑米色素待测样品代替上一试验操作中的过氧化氢，重复操作，可分别得到不同样品管的吸光度（A样）。除此之外，做空白对照组，将1 mL蒸馏水代替上述操作过程中的黑米色素待测样品，重复上述试验操作，可得到未损伤的吸光度（A未）。通过下式计算抑制率：

清除率=（A样-A损）/（A未-A损）×100%

2 结果与分析

2.1 黑米色素提取工艺

2.1.1 料液比对提取率的影响。

由图1可见，黑米色素的提取过程中，料液比的不同，会影响到提取物最终的浓度。试验结果表明：当料液比逐渐升高时，黑米色素的提取率也随之升高，但是当料液比升高到一定程度时，提取率反而降低。这可能是由于当料液比逐渐增大时，由于提取溶液内不同分子之间有浓度差，因此产物分子扩散较快，进而提取率也就会随之升高；
但是当料液比增大到一定程度时，由于提取溶液内不同分子之间的浓度差变小，提取率趋于平衡，从而导致浓度不再增加甚至减小。试验中，当料液比达到1∶6时，提取效果最佳。

2.1.2 提取时间对提取率的影响。

在原料中提取目标产物的过程中，有效目标成分的高低和析出伴随着提取持续时间的移长而逐渐增大，直至原料中溶解产物的有效目标产物浓度达到平衡值，因此没有必要无限度地延长提取时间。图2显示，在原料浸提时间10～30 min时，浸提时间越长，黑米色素的吸光值越大，黑米色素的提取率也越大，但30 min后的吸光值反而下降，这可能是由于原料浸提的时间持续过长致使体系温度升高，从而直接导致黑米色素受到严重破坏，并且还会大大地增加生产成本。因此，建议选择30 min为最佳浸提时间。

2.2 黑米色素提取物DPPH自由基清除能力

该试验得出，黑米色素对DPPH自由基有一定的清除能力，并将其与抗氧化剂VC的清除能力进行比较，结果如图3所示。从图3可见，黑米色素和VC对于DPPH自由基均具有不同程度的分解和清除功效，且随着浓度的增大，它们的清除能力也随之增强。在所选添加量范围内，DPPH自由基清除率与黑米色素添加量呈正相关，随着黑米色素中主要成分花色苷的浓度增加，清除率能达到70%以上。

2.3 黑米色素提取物超氧阴离子清除能力

为了准确判断新型酚类黑米色素中超氧阴离子的氧化清除能力和抑制作用能力，将其与标准抗氧化剂VC对酚类邻苯三酚的自由基氧化降解反应产生的一种超氧阴性离子清除抑制能力进行比较。

由图4可知，黑米色素提取物与VC对超氧阴离子均具有不同程度的分解和抑制作用，并且当它们处于试验浓度范围内时，它们的抑制性功效是随着试验浓度的提高而逐渐增大，但黑米色素与VC相比，对超氧阴离子的净化能力相对较弱。

2.4 黑米色素提取物羟基自由基清除能力

羟基自由基是一种重要的化学活性氧，其物理化学结构特征活泼，是通过引发不饱和脂肪酸而直接产生对饱和脂质的一种过氧化活性反应，它具有损伤膜和多种生物大分子结构与功能的能力。其氧化性是由于氢氧根在结构中失去1个负价电子而形成。当其中加入羟基自由基清除剂时，孤电子与其配对，吸收性就会消失或衰减。

由图5可知，黑米色素提取物与VC相比，在一定浓度范围内较弱，但当浓度达到一定高度时，黑米色素的羟基清除能力反而高于VC。由图5可知，在浓度为0～<0.30 mg/mL时，VC对羟基自由基的清除率大于黑米色素，因此低剂量的情况下，VC对羟基的抗氧化能力较强；
当浓度为0.30～0.50 mg/mL时，随着浓度增大，黑米色素对羟基自由基清除率大于VC；
当达到50%清除率时所需黑米色素浓度为0.25 mg/mL，而VC所需浓度为0.20 mg/mL，很明显VC在该条件下对羟基抗氧化能力较强。当黑米色素浓度达到0.40 mg/mL以上，由于大部分羟基自由基在反应中被消除，因此羟基自由基清除率变化不大。

3 讨论

黑米色素属于花色苷类，极易溶于乙醇等极性较大的溶剂，却难以直接溶于极性低或非极性的溶剂，因此可通过乙醇萃取法来提取该色素。黑米色素的提取工艺中重要影响因素最佳参数为料液比1∶6，提取时间为30 min，但根据原料和其他条件可作适当调整。

我国由于拥有丰富的黑米资源，黑米的生产、加工、利用具有广阔的发展前景，而且黑米色素具有很强的人体生理学功能，是一种被广泛应用于众多行业领域的理想天然材料，食品与生物医药等行业对于黑米色素的要求也越来越高，使得有色稻米产业发展具有更加广阔的市场前景。

参考文献

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［9］ 王凤洁，沈国良，王永杰，等.黑米色素稳定性及应用研究［J］.农业机械，2011（10）：160-163.

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基金项目 安徽省教育厅高校教师自然科学研究项目“有色稻籽粒颜色遗传分析与功能性分子标记的设计”（KJ2018A0356）。

作者简介 吴娟（1980—），女，安徽寿县人，副教授，硕士生导师，从事作物遗传育种研究。

收稿日期 2022-07-22

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