绿原酸处理对鲜切马铃薯品质和γ-氨基丁酸积累的影响

王春飞 汤 静 陈逸婷 孟宪伟 金 鹏 郑永华

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

马铃薯（SolanumtuberosumL.）块茎含有丰富的淀粉，同时还含有膳食纤维、维生素及其他活性成分，能给人体提供丰富的热量，有“地下苹果”的美称［1］。随着鲜切果蔬市场的不断扩大，鲜切马铃薯因新鲜、卫生、方便等优点广受消费者欢迎。然而马铃薯经削皮、切分等机械损伤后易发生表面褐变［2-3］、营养物质损失［4-5］及微生物侵染［6-7］等问题，继而引起感官品质及商品性的降低，限制其产业的发展。因此寻找合适的保鲜方法，以减轻鲜切马铃薯贮藏期间品质劣变现象和延长货架期，是鲜切马铃薯产业健康发展的核心。已有研究表明，包括绿原酸（chlorogenic acid，CGA）在内的许多酚类物质可以抑制鲜切果蔬褐变［8-10］、营养物质损失［9-10］和微生物生长［11］，从而延长鲜切产品的货架期。因而绿原酸等酚类物质处理在鲜切果蔬保鲜中具有较好的应用前景。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）作为一种四碳、非蛋白质氨基酸，在动植物、微生物体内广泛存在，能帮助人们减轻压力，起到降低血压、缓解焦虑和促进睡眠的作用［12］。植物体内GABA 的形成包括GABA支路和多胺降解两条途径，前者是由谷氨酸（glutamic acid，Glu）经谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）催化形成GABA；
后者是二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）或多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）催化降解多胺生成4-氨基丁醛，然后通过4-氨基丁醛脱氢酶（4-amino aldehyde dehydrogenase，AMADH）催化进一步生成GABA［13-14］。研究表明，植物在遭遇低温、干旱、低氧及机械损伤等逆境胁迫时，体内会积累大量的GABA，从而提高自身抗逆性［15-16］。研究发现，果蔬经切分处理后也会积累大量的GABA，从而提高自身的营养价值。如侯莹等［17］和游万里等［18］研究发现，鲜切加工可以促进鲜切猕猴桃和鲜切哈密瓜GABA 的合成积累，且切分强度越大，合成积累效果越明显。鲜切加工也可促进鲜切火龙果和鲜切莴苣中GABA的积累，且外源氯化钙处理可进一步促进GABA含量的增加［19-20］。因此，鲜切加工和采后处理有望成为提高鲜切果蔬GABA 含量和营养价值的有效方式。但绿原酸处理对鲜切马铃薯贮藏期间GABA 含量的影响仍鲜见报道。因此，本试验首先依据鲜切马铃薯贮藏品质及GABA含量变化筛选最优绿原酸处理浓度，然后探讨绿原酸促进GABA 积累的可能机制，以期为鲜切马铃薯的保鲜和营养价值的提升提供依据。

1.1 材料与试剂

以V7 品种马铃薯为试验材料，选择大小均一、表皮完整、无机械损伤和病虫害的新鲜马铃薯。

绿原酸（98%）、辣根过氧化物酶，上海阿拉丁生物试剂有限公司；
福林酚（分析纯）、乙醇（分析纯）、4-氨基丁醛、氯化镧、L-谷氨酸，南京丁贝生物科技有限公司；
硼酸、硼砂、磷酸钾，南京安卓生物科技有限公司；
二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、磷酸吡哆醛、L-苯丙氨酸、苯甲基磺酰氟，南京迈博昊成生物科技有限公司；
GABA转氨酶（GABA aminotransferase，GABA-T）ELISA试剂盒，江苏酶免实业有限公司。

1.2 主要仪器与设备

CS-200型精密色差仪，南京沃拓实验仪器设备有限公司；
UV-1900型紫外可见分光光度计，上海精其仪器有限公司；
ZQTY-50S 振荡器，上海知楚仪器有限公司；
TGRL-16型台式高速冷冻离心机，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.3 试验方法

浓度筛选试验：马铃薯经消毒、晾干和去皮后切成3 mm厚的片状，分别用蒸馏水及10、30、50和70 mg·L-1绿原酸溶液浸泡10 min。处理结束取出置于洁净纱布上，待表面无多余水分后，放入长15 cm、宽10 cm、高6 cm的塑料盒中，在4 ℃下贮藏72 h。分别于贮藏6、12、24、48和72 h取样，取样时每一处理均随机选取4盒样品，一部分用于品质指标测定，另一部分经液氮速冻后测定GABA含量。

机制探究试验：将鲜切马铃薯片随机分成两组，分别用蒸馏水和适宜浓度绿原酸溶液浸泡处理10 min，取出置于洁净纱布上，待表面无多余水分后，放入长15 cm、宽10 cm、高6 cm 的塑料盒中，在4 ℃下贮藏72 h。分别于贮藏6、12、24、48 和72 h 取样，取样时每一处理均随机选取4 盒样品，一部分用于品质指标测定，另一部分经液氮速冻后测定GABA 含量及代谢相关酶活性。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 色泽 采用色差仪测定L*值。

1.4.2 菌落总数 按照《GB 4789.2-2016 食品微生物学检验 菌落总数测定》［21］的方法，检测鲜切马铃薯中菌落总数，单位为lg（CFU·g-1）。

1.4.3 淀粉含量 参照曹建康等［22］的碘-淀粉比色法并加以修改。称取1 g样品并加入3 mL乙醚研磨，然后加入5 mL 80%乙醇混匀，于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min后保留滤渣并用去离子水定容至5 mL，沸水浴30 min后继续离心。反应体系为0.1 mL上清液、4.88 mL去离子水和0.02 mL 碘液，混匀并稳定5～10 min，测定660 nm波长下的吸光度值，单位为mg·g-1FW。

1.4.4 GABA 含量 参考Wang等［23］的方法并加以修改。在研钵内，用5 mL 0.1 mol·L-1氯化镧提取液冰浴研磨0.5 g冷冻样品，置于离心管后摇床充分震荡10 min，低温离心吸取上清备用。准确吸取200 µL 2 mol·L-1氢氧化钾溶液加入1.5 mL上清液中，震荡5 min后继续离心。取400 µL上清，依次加入100 µL 2 mol·L-1氢氧化钾溶液，50 µL 0.5 mol·L-1pH值9.0的硼酸-硼砂缓冲液，600 µL 6%苯酚溶液和300 µL有效氯浓度≥5.5%的次氯酸钠溶液，5 min 沸水浴后插入冰盒降温，然后加入500 µL 70%乙醇，30 min内测定645 nm处的吸光值。

1.4.5 谷氨酸含量 参考Wang 等［23］和Al-Quraan等［24］的方法并稍加修改。称取0.5 g 样品并加入3 mL 0.05 mol·L-1氯化镧冰浴研磨，于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，在玻璃试管内加入0.05 mL 上清液和3 mL反应液，于30 ℃孵育60 min，测定340 nm 波长下吸光度值的变化，并以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）标准曲线为基础衡量谷氨酸水平，最终结果以mg·g-1FW表示。

1.4.6 GAD活性 参考Liao等［25］的方法稍加修改。称取0.5 g样品，用3 mL 0.1 mol·L-1pH值6.5的磷酸钾缓冲液［内含5 mmol·L-1β-巯基乙醇、0.5 mmol·L-1磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）、2 mmol·L-1乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、10%（v/v）甘油］低温研磨后离心收集上清。吸取1 mL 0.2 mol·L-1pH 值5.8 的磷酸钾缓冲液（内含40 µmol·L-1PLP、3 mmol·L-1Glu），加入1.5 mL 上清，该反应以0.5 mL 1 mol·L-1三氯乙酸终止。GAD 活性用每小时生成0.01 µmol的GABA表示。

1.4.7 GABA 转氨酸（GABA aminotransferase,GABAT）活性 利用ELISA试剂盒双抗体夹心法测定。

1.4.8 腐胺、亚精胺和精胺含量 参考Li 等［26］的方法并加以修改。准确称取2 g样品，用3 mL 5%预冷高氯酸研磨均质，4 ℃孵育1 h。于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min 后取2 mL 上清，加入0.01 mL 苯甲酰氯和2 mL 2 mol·L-1NaOH，充分混合。置于35 ℃水浴锅内20 min，加入2 mL 冰冻无水乙醚和饱和NaCl 后低速（4 ℃、4 000 r·min-1）离心5 min。取1 mL 醚相氮吹，用400 µL纯甲醇溶解氮吹残留物，最后用0.22 µm有机滤膜过滤至液相小瓶内备用。色谱条件：柱温28 ℃，进样量20 µL，流速0.8 mL·min-1，流动相为35%水（A）和65%甲醇（B），多胺含量依据相应标准曲线得出。

1.4.9 DAO、PAO 和AMADH 活性 DAO、PAO 活性测定参考Wang等［27］和Gao等［28］的方法并稍加修改。取1 g 样品，用2 mL 0.1 mol·L-1pH 值6.6 的磷酸钾缓冲液冰浴研磨，于4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min 后取0.5 mL上清，加入0.2 mL辣根过氧化物酶（250 U·mL-1），1.5 mL 0.1 mol·L-1pH 值6.6的磷酸钾缓冲液，0.3 mL 4-氨基安替比林（100 mg·L-1）/N，N-二甲基苯胺显色液（200 µL·L-1）。DAO 加入0.4 mL 腐胺溶液启动反应，PAO加入0.4 mL 亚精胺+精胺混合液启动反应，分别测定555 nm 处初始值和反应30 min 后末值，以吸光度值每分钟变化0.01为一个酶活单位。

AMADH 活性测定参考Wang 等［23］的方法稍加修改。测定样品在340 nm处吸光值的变化。

1.5 数据处理

上述指标均取3 个平行样作3 次重复测定。数据和图像分别采用SAS 2020 和Origin 2020 软件分析和绘制，以邓肯氏多重比较检验数据间差异显著性，以P<0.05表示差异达到显著水平。

2.1 不同浓度绿原酸处理对鲜切马铃薯色泽和菌落总数的影响

色泽和菌落总数是反映鲜切马铃薯品质的重要指标。新鲜马铃薯切分后呈淡黄色，随着贮藏时间延长，切片表面容易发生褐变，引起感官品质和商品价值的降低。L*值表示明亮程度，是反映马铃薯褐变程度的主要指标，L*值越大表示褐变程度越小。如图1-A 所示，贮藏期间各组L*值均不断降低，说明鲜切马铃薯的色泽逐渐变暗，发生了褐变。绿原酸处理组L*值始终高于对照组，说明不同浓度绿原酸均可以延缓鲜切马铃薯的褐变，以30 mg·L-1绿原酸处理抑制褐变效果最好。

图1 不同浓度绿原酸处理对鲜切马铃薯L*值（A）和菌落总数（B）的影响Fig.1 Effects of chlorogenic acid treatment with different concentrations on L* value （A），and total bacterial count （B）of fresh-cut potatoes

马铃薯经切分后，营养物质外渗使其更易遭受微生物侵染，导致品质降低甚至腐烂不可食用。鲜切马铃薯新鲜程度和食用安全性与菌落总数密切相关，菌落总数越高，新鲜度和食用安全性越低。如图1-B 所示，随着贮藏时间的延长，各组菌落总数均不断上升，且前48 h 增长速度快，后期增长缓慢。这反映出贮藏前期，微生物依靠充足营养物质大量繁殖，后期可能进入增长平台期。绿原酸处理组菌落总数始终低于对照组，且呈现明显的浓度效应，处理浓度越高，抑菌效果越好，经过72 h 贮藏后，70 mg·L-1浓度绿原酸处理组菌落总数比对照组减少近1 lg（CFU·g-1）。

2.2 不同浓度绿原酸处理对鲜切马铃薯淀粉和GABA含量的影响

马铃薯中含有丰富的淀粉，是评价马铃薯营养价值的重要指标。如图2-A所示，鲜切马铃薯贮藏期间，淀粉含量逐渐下降，不同浓度绿原酸均可抑制其降低，其中30 mg·L-1浓度绿原酸效果最佳。贮藏72 h后，30 mg·L-1浓度处理组淀粉含量比对照组高8%，具有显著差异。

图2 不同浓度绿原酸处理对鲜切马铃薯淀粉（A）和GABA（B）含量的影响Fig.2 Effects of chlorogenic acid treatment with different concentrations on starch （A） and GABA（B） contents of fresh-cut potatoes

如图2-B 所示，鲜切马铃薯贮藏期间，GABA 含量呈前期升高后期降低的趋势。绿原酸处理均提高了鲜切马铃薯中GABA含量，其中30 mg·L-1绿原酸处理效果最显著，贮藏12 h 时其GABA 含量是对照组的1.5 倍，是初始值的1.8倍，GABA积累效果显著。

以上结果表明，30 mg·L-1浓度绿原酸在保持鲜切马铃薯贮藏品质和促进GABA 积累方面效果最佳，因此后续试验研究了该浓度绿原酸处理对GABA 代谢相关酶活性的影响，以探究绿原酸处理促进鲜切马铃薯GABA积累的机理。

2.3 30 mg·L-1浓度绿原酸处理对鲜切马铃薯GABA支路途径的影响

谷氨酸是GABA 合成的重要底物，在GAD 的作用下分解形成GABA，而GABA-T 则是分解GABA 的关键酶，能够降低GABA 含量。如图3-A 所示，鲜切马铃薯在贮藏期间谷氨酸含量先降低后趋于稳定，说明谷氨酸分解和GABA 的合成集中在贮藏前期。绿原酸处理组的谷氨酸含量在前48 h 始终低于对照组，说明绿原酸处理促进了支路途径中谷氨酸向GABA 的转化。如图3-B 所示，GAD 活性先升高后波动降低，且绿原酸处理组始终高于对照组，说明处理组GAD 活性增强是谷氨酸分解的原因。如图3-C 所示，GABA 含量变化与GAD 变化相似，前12 h 迅速上升，后期波动下降；
贮藏12 h时，处理组和对照组GABA 含量均达到高峰，处理组比对照组显著提高了27%。如图3-D 所示，对照组GABA-T活性在贮藏前24 h呈上升趋势，后期降低；
处理组GABA-T 活性在贮藏期间缓慢降低且始终低于对照组，说明绿原酸处理可以抑制GABA-T活性，从而抑制GABA 的分解。这些结果说明，绿原酸调控了GABA 支路关键酶活性，通过提高GAD 活性促进了GABA 合成，通过降低GABA-T 活性抑制了GABA分解，从而促进了鲜切马铃薯中GABA的积累。

图3 绿原酸处理对鲜切马铃薯Glu含量（A）、GAD活性（B）、GABA含量（C）和GABA-T活性（D）的影响Fig.3 Effects of chlorogenic acid treatment on glutamic acid content （A），GAD activity （B），GABA content（C） and GABA-T activity （D） of fresh-cut potatoes

2.4 30 mg·L-1浓度绿原酸处理对鲜切马铃薯多胺降解途径的影响

多胺降解是GABA 合成的另一重要途径。多胺在DAO或PAO作用下先生成4-氨基丁醛，然后在AMADH的作用下分解生成GABA。由图4可知，随着贮藏时间的延长，3 种多胺含量整体均呈降低趋势，且处理组的多胺含量低于对照组，说明绿原酸处理能够促进多胺分解生成GABA。由图5可知，DAO和PAO活性在贮藏期间的变化趋势一致，即先升高后降低，均在贮藏6 h达到最高值且处理组显著高于对照组，这与GABA 合成变化趋势一致。AMADH 活性在贮藏期间呈下降趋势，处理组AMADH 活性在前48 h 高于对照组。以上结果表明，绿原酸处理提高了多胺降解途径中关键酶活性，从而促进了多胺的降解及GABA的合成。

图4 绿原酸处理对鲜切马铃薯腐胺（A）、亚精胺（B）和精胺含量（C）的影响Fig.4 Effects of chlorogenic acid treatment on putrescine （A），spermidine （B） and spermine contents （C） of fresh-cut potatoes

图5 绿原酸处理对鲜切马铃薯DAO活性（A）、PAO活性（B）和AMADH活性（C）的影响Fig.5 Effects of chlorogenic acid treatment on DAO （A），PAO （B），and AMADH （C） activities of fresh-cut potatoes

鲜切果蔬是新鲜蔬菜和水果经清洗消毒、去皮切分和包装等操作制成的产品，因具有安全、卫生、方便的优点，成为果蔬产业发展的热点。然而鲜切果蔬在贮藏期间易出现褐变、微生物生长繁殖、营养物质损失甚至腐烂等问题，造成品质降低。酚类物质是果蔬中重要的次生代谢产物，能够减少和降低各种胁迫对果蔬造成的损害。已有研究表明，外源酚类物质可以延缓鲜切果蔬品质下降，从而起到保鲜的作用。杨明阳等［29］发现绿原酸处理可以减轻鲜切贡梨和鲜切苹果切片的褐变和异味产生，保持更好的感官品质；
阿魏酸处理可以通过抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性，显著减轻鲜切荸荠表面黄变的现象［30］；
槲皮素处理降低了鲜切马铃薯中酚类物质的积累和丙二醛的生成，防止了鲜切马铃薯的褐变，延长了货架期［31］。本研究中，30 mg·L-1绿原酸处理可显著抑制鲜切马铃薯褐变和微生物生长，同时保持较高的淀粉含量，并促进GABA 的合成积累，在维持鲜切马铃薯感官和营养品质上发挥着积极作用，因而在鲜切马铃薯保鲜中具较好的应用前景。

GABA 合成积累是植物遭受逆境胁迫时迅速做出的反应，这种改变能使植物产生更高的抗逆性，以减轻逆境胁迫对植物造成的损害。GABA 有GABA 支路和多胺降解两条合成途径。无论通过哪条途径，GABA合成积累均与相关酶活性密切相关，很多逆境胁迫都是通过调节相关酶活性来促进GABA 积累的［14，32］。如鲜切加工造成的机械损伤通过提高GABA 支路中合成关键酶GAD 活性促进鲜切猕猴桃和哈密瓜中谷氨酸向GABA 的转化合成［17-18］；
采用CaCl2处理显著提高了GAD 活性，加速了谷氨酸分解，从而促进了鲜切火龙果［19］、莴苣［20］、梨［33］和马铃薯［34］GABA 的合成积累；
Deewatthanawong 等［35］研究发现高浓度CO2处理可促进番茄果实中GABA 的积累，同时抑制GABA 分解关键酶GABA-T 的活性，而对GAD 活性影响不大，说明该处理条件下番茄中GABA 的积累可能主要得益于较低的GABA 分解速度；
Yan 等［36］研究发现短波紫外线处理促进番茄果实贮藏期间GABA 积累，这是GAD 活性增高和GABA-T活性降低共同作用的结果。本研究中，绿原酸处理显著促进了鲜切马铃薯中GABA 的积累，同时提高了GABA 支路途径中GAD 活性而抑制了GABA-T活性，表明GABA含量得到积累与绿原酸促进GABA合成和抑制GABA分解有关。谷氨酸作为GABA合成的重要底物，其含量在贮藏前期明显降低且处理组低于对照组，表明处理组GAD 活性升高促进了谷氨酸向GABA 的分解转化。GAD 活性受到pH 和Ca2+的影响［37-38］，本研究中绿原酸处理提高GAD 活性可能是其提供了弱酸性环境，也有可能是绿原酸通过调节Ca2+浓度提高GAD 活性，进而调控GABA 合成，但具体机理有待进一步研究。多胺降解是GABA 合成的另一主要途径。已有研究表明鲜切加工和CaCl2处理可提高该途经关键酶DAO、PAO 及AMADH 活性，促进鲜切鲜火龙果［19］、莴苣［20］、胡萝卜［23］和梨［33］GABA 的积累。本研究中，绿原酸处理也提高了鲜切马铃薯DAO、PAO及AMADH活性，从而促进了多胺向GABA的分解转化。总之，绿原酸处理通过提高GABA支路和多胺降解途径中GABA合成关键酶GAD、DAO、PAO和AMADH活性，可促进GABA合成，并抑制GABA分解酶GABA-T活性以减少其分解，从而促进鲜切马铃薯中GABA的积累。

本研究结果表明，外源绿原酸处理可以显著抑制鲜切马铃薯L*值的降低，减轻褐变程度，减少微生物侵染，并保持较高的淀粉含量，维持鲜切马铃薯较好的品质。同时，绿原酸处理通过提高GABA 合成关键酶GAD、DAO、PAO、AMADH 活性和抑制GABA 分解酶GABA-T 活性，促进了谷氨酸和多胺分解生成GABA，同时减少了GABA 的分解消耗，从而促进了GABA 的积累，提高了鲜切马铃薯抗氧化活性与营养品质。

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