基于网络药理学探讨石丹颗粒治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制

蔡玉丰,李欢,钱正刚,2,柳航,2,奚肇宏,张华军,胡巍,2

(1.南京中医药大学鼓楼临床医学院,江苏 南京 210008;2.南京鼓楼医院药学部,江苏 南京 210008;3.江苏省中西医结合医院消化科,江苏 南京 210028;4.南京鼓楼医院中医科,江苏 南京 210008)

慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)又称胃癌前期病变,是胃癌发展过程中重要环节,其机制主要与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等有关[1-3]。由于患病人数多,易反复发作,已成为重要公共卫生问题,近年来有研究报道发现中药复方治疗CAG的疗效显著,可有效缓解症状,改善患者体质,防止其向胃癌进一步发展[4-5]。石丹颗粒(Shidan granule,SDG)是江苏省中西医结合医院院内协定方,由党参、黄芪、白术、茯苓、石见穿、土茯苓、薏苡仁、丹参、广木香等13味中药组成,有益气健脾,化瘀通络之效。前期研究表明SDG不仅可以通过抑制NF-κB信号通路以减轻炎症,还能够调节能量平衡,对CAG有明显的疗效[6-7]。但作为复杂的中药复方,传统的药理学研究策略存在一定的局限性,其作用机制难以完全阐明。如何深入阐释SDG治疗CAG的分子机制,对于临床上SDG的广泛应用具有重要意义。网络药理学作为多学科交叉研究手段,对于发现中药复方药物靶点,揭示其科学内涵有显著优势[8]。因此,本研究运用网络药理学的方法,筛选SDG有效成分,分析其治疗CAG的作用靶点及相关信号通路。并基于此进行相关实验验证,探讨SDG治疗CAG的作用机制,为后续研究奠定基础。

1.1 网络药理学

1.1.1 石丹颗粒活性成分的筛选及靶点预测 通过中药系统药理学数据库和分析平台[9](TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索SDG各中药化学组成成分,根据2个ADEM参数口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性≥0.18(Drug likeness,DL)进行活性成分初步筛选以获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点。近年来,本团队致力于SDG物质基础和作用机制的研究,经前期对SDG的体内外成分鉴定,补充活性成分并预测其靶点[10]。筛选结束后,经Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)将化合物作用的蛋白质靶点信息进行规范化处理。

1.1.2 慢性萎缩性胃炎相关靶点筛选 以“chronic atrophic gastritis”为关键词,挖掘GeneCards数据库[11](https://www.genecards.org/)、OMIM数据库[12](https://omim.org/)中治疗CAG的潜在靶点。

1.1.3 蛋白质互作网络构建及核心靶点筛选 为明晰SDG药物相关靶点与CAG靶点间的相互作用,通过Sangerbox 3.0在线作图平台[13](http://vip.sangerbox.com/login.html)将二者靶点取交集并绘制韦恩图。进而将交集靶点提交至String11.0数据库[14](https://cn.string-db.org/)构建蛋白互作(Protein-protein interaction,PPI)网络模型,将生物种类设定为“Homo sapiens”,得到PPI网络。为筛选发挥作用的核心靶点,将PPI网络导入Cytoscape 3.9.0软件,利用其Network Analyzer内置分析工具对PPI网络进一步分析,获得各靶点的网络拓扑参数,包括连接度(Degree)、介度(Betweenness)及紧密度(Closeness)等,而后通过Cytoscape 3.9.0软件Cytohubba插件基于Degree算法筛选核心靶点,将其可视化[15]。

1.1.4 “药物-活性成分-疾病-靶点”网络图的构建及分析 通过Cytoscape 3.9.0软件构建“石丹颗粒药物-活性成分-慢性萎缩性胃炎-靶点”网络。为探讨SDG发挥药效的潜在化合物,运用Cytoscape 3.9.0软件中Network Analyzer获得连接度(Degree)、介度(Betweenness)及紧密度(Closeness)等网络拓扑参数,并根据Degree值判断主要活性成分。

1.1.5 靶点GO功能与KEGG通路富集分析 通过DAVID数据库[16-17](https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)对“石丹颗粒-慢性萎缩性胃炎交集靶点”进行GO功能与KEGG代谢通路富集分析,其中GO功能分析包括生物过程(Biological process,BP)、细胞成分(Cellular component,CC)、分子功能(Molecular function,MF)三部分,利用Sangerbox 3.0对保存的数据结果进行可视化。

1.1.6 分子对接验证 通过TCMSP数据库下载SDG中排名前7的关键活性成分的3D结构;通过RCSB数据库(https://www.rcsb.org/)查找并下载排名前10的核心靶点的3D晶体结构。利用AutodockTools1.5.6软件对靶点结构进行去水、加氢、加电荷处理,再利用Autodock Vina1.1.2软件对活性成分和靶点进行分子对接操作,以Affinity结合能值来评价二者的结合强度并通过Sangerbox 3.0对结果进行可视化[18-19]。最后利用Pymol 2.5软件对部分对接结果以Affinity值最低位点的图像进行可视化。

1.2 实验验证

1.2.1 细胞 人胃黏膜上皮细胞(GES-1细胞)购自上海赛百慷生物技术股份有限公司。

1.2.2 试剂N-甲基-N"-硝基-N-亚硝基胍(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine,MNNG,批号:C14503078)购自上海麦克林生化科技有限公司;SDG药液由南京鼓楼医院提供;RPMI 1640培养基(批号:KGM31800)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,批号:KGY008)、全蛋白提取试剂盒(批号:KGP250)、细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8,批号:BS350A)均购自凯基生物;人IL-6、TNF-αELISA试剂盒(批号:A10620524,A18221132)购自联科生物;磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS,批号:G4202)、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒(批号:G2026)、蛋白激酶B1(Protein kinase B1,Akt1,批号:GB111114)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6,批号:GB11117)、肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor-α,TNF-α,批号:GB11188)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,批号:GB15002)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HPR)标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG抗体(批号:GB23301,GB23303)均购自武汉赛维尔生物科技有限公司。磷酸化Akt1(Phosphorylated-Akt1,p-Akt1,批号:AF0908)购自美国Affinity公司。

1.2.3 仪器 细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)、全自动酶标检测仪(美国Thermo Fisher公司)、荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)、电泳系统(美国Bio-Rad公司)、曝光仪(上海Tanon公司)。

1.2.4 细胞培养、模型构建及给药 GES-1细胞用含10%FBS、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。用30 μmol·L-1MNNG孵育GES-1细胞24 h诱导模型的形成,之后分别给予低、中、高剂量(50、100、125 μg·mL-1)的SDG药液干预24 h,对照组不予诱导与干预处理。

1.2.5 CCK-8法检测细胞活性 取对数生长期细胞,将细胞接种在96孔板中,每孔6×103个细胞,细胞长满至70%～80%时,进行下一步干预处理。对照组加入不含药物的培养基,干预组分别给予不同浓度(0、5、10、20、30、40 μmol·L-1)的MNNG培养24 h;30 μmol·L-1MNNG诱导24 h后,用不同浓度(0、20、50、100、125、150 μg·mL-1)的SDG药液培养24 h。之后吸去每孔上清液,每孔加入100 μL检测试剂(10 μL CCK-8溶液+90 μL无血清培养基),继续孵育2 h后用酶标仪在450 nm波长下检测各孔吸光度值,计算细胞存活率。

1.2.6 ELISA检测炎症因子 按照“1.2.4”项下方法处理细胞并给药后,收集细胞上清液,按照酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒说明书操作,测定培养液中IL-6和TNF-α的含量。

1.2.7 qPCR检测相关基因表达 按照“1.2.4”项下方法处理细胞并给药后,收集细胞,采用荧光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测GES-1细胞Akt1、IL-6、TNF-α mRNA的表达,运用2-ΔΔCt法计算各组基因相对表达量。引物信息见表1,引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.8 Western blot检测相关蛋白表达 按照“1.2.4”项下方法处理细胞并给药后,收集细胞并于冰上裂解,采用Western blot半定量分析各组细胞Akt1、p-Akt1、IL-6、TNF-α蛋白表达水平。使用Image J软件分析条带灰度值,对目的蛋白相对表达量进行统计。

2.1 网络药理学分析结果

2.1.1 石丹颗粒活性成分靶点的获取 经TCMSP数据库检索筛选得到SDG活性成分229个,靶点262个。基于团队前期对SDG体内外成分研究对活性成分进行补充,整合后得到SDG活性成分共230个,靶点共268个,结果见表2。

表2 石丹颗粒活性成分数及靶点数Table 2 Numbers of active components andtargets of Shidan Granules

2.1.2 慢性萎缩性胃炎相关靶点的获取 经GeneCards数据库、OMIM数据库检索筛选得到CAG靶点个数分别为404、86,去除重复值后得到484个疾病相关靶点。

2.1.3 PPI网络构建及核心靶点筛选 通过Sangerbox 3.0将筛选的SDG成分靶点与CAG靶点取交集,并绘制韦恩图,得到“石丹颗粒-慢性萎缩性胃炎”共同靶点82个,见图1。随后将82个交集靶点提交至String11.0平台,通过Cytoscape 3.9.0软件将PPI网络图可视化,见图2,其中网络图中节点的大小代表相应的度值,节点越大则Degree值越大,具体参数见表3。再利用Cytohubba插件筛选并绘制Degree排名前10的核心靶点网络图,见图3,结果表明这10个靶点可能是SDG治疗CAG的潜在治疗靶点,其中IL-6、Akt1和TNF的Degree最高为140,预测三者为最主要的靶点。

图1 “石丹颗粒-慢性萎缩性胃炎”靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of targets in ShidanGranules-chronic atrophic gastritis

图2 “石丹颗粒-慢性萎缩性胃炎”交集靶点PPI网络图Fig.2 Protein-protein interaction network of ShidanGranules-chronic atrophic gastritis

图3 前10核心靶点网络图Fig.3 Diagram of the top 10 core target network

表3 核心靶点网络拓扑学分析结果(Degree前10)Table 3 Core target network topology analysisresults (Degree Top 10)

2.1.4 “石丹颗粒药物-活性成分-慢性萎缩性胃炎-靶点”网络图的构建及分析 利用Cytoscape 3.9.0软件对“药物-活性成分-疾病-靶点”的关系网络进行可视化并分析,共获得258个节点和879条关系,结果见图4。网络图中节点大小与Degree值成正比。使用软件内置工具Network Analyzer分析活性成分网络拓扑参数,活性成分的网络拓扑参数结果见表4,结果显示槲皮素、木犀草素、豆甾醇、常春藤皂苷元的Degree值较高,表明上述成分是SDG治疗CAG的主要有效成分。

注:正方形.药物;八边形.药材;菱形.活性成分;六边形.疾病;圆形.靶点图4 “药物-活性成分-疾病-靶点”网络图Fig.4 Drugs-components-disease-targets interaction network

表4 主要活性成分网络拓扑学分析结果(Degree前10)Table 4 Network topology analysis results of main active ingredients (Degree Top 10)

2.1.5 GO功能与KEGG通路富集分析 将得到的SDG治疗CAG的82个作用靶点导入DAVID数据平台进行GO功能和KEGG通路富集分析。针对富集程度排名前20的GO分析结果绘制气泡图,包括生物功能(图5A)、细胞成分(图5B)、分子功能(图5C)。GO富集结果显示SDG活性成分主要作用于细胞质、基质膜、核质、线粒体等;分子功能包括调节酶结合、细胞因子活性、生长因子活性、蛋白质结合和磷酸化、DNA结合转录因子、NF-κB结合等;生物过程包括细胞凋亡、细胞增殖、DNA转录、RNA结合酶Ⅱ转录等。

注:A.GO-BP分析;B.GO-CC分析;C.GO-MF分析;D.KEGG分析图5 石丹颗粒治疗慢性萎缩性胃炎作用靶点富集气泡图Fig.5 Target enrichment bubble map of Shidan Granules in treatment of chronic atrophic gastritis

KEGG通路富集分析共得到152条富集信息,结果显示作用靶点主要涉及的信号通路有IL-17信号通路、TNF信号通路、癌症中的蛋白聚糖、PI3K-Akt信号通路等,将富集程度排名前20的结果可视化,见图5D。

2.1.6 分子对接结果 将7种关键活性成分分别与10个核心靶点IL-6(PDBID:7NXZ)、Akt1(PDBID:1GZK)、TNF(PDBID:2E7A)、TP53(PDBID:1UOL)、VEGFA(PDBID:1MJV)、IL-1β(PDBID:1HIB)、MMP9(PDBID:5TH6)、STAT3(PDBID:6NJS)、CASP3(PDBID:3DEH)、PTGS2(PDBID:5IKT)进行分子对接,得到70组对接结果。其中Affinity<-5 kcal·mol-1(1 kcal≈4.185 85 kJ)的组合共有69组,Affinity<-7 kcal·mol-1的有50组,结果表明绝大部分靶点与关键成分的结合活性较好,分子对接结果见图6,其中豆甾醇与CAPS3蛋白结合能为-10.4 kcal·mol-1,表明二者结合活性最优。随后将IL-6、Akt1、TNF分别与槲皮素、木犀草素、豆甾醇、常春藤皂苷元分子对接结果可视化处理,见图7。对接结果显示各活性成分均嵌入靶点的活性口袋中,分别与IL-6、Akt1、TNF中的多个氨基酸残基通过形成氢键发生作用,其中槲皮素分子对接结果构象更为稳定,如图7所示,槲皮素通过与IL-6的LEU-63、SER-168氨基酸残基形成3个氢键;通过与Akt1的ASP-354、PHE-350、GLY-346氨基酸残基形成3个氢键;通过与TNF的SER-99、ARG-98、GLU-116氨基酸残基形成9个氢键。

图6 分子对接结果Fig.6 Results of molecular docking

图7 石丹颗粒主要活性成分与核心靶点分子对接图Fig.7 Molecular docking diagram of main active components and core target of Shidan Granules

2.2 实验验证

2.2.1 细胞活力检测结果 经CCK-8检测并计算细胞活力,结果显示当以30 μmol·L-1浓度的MNNG培养GES-1细胞24h后,细胞活力与对照组相比明显下降(P<0.01),见图8A,故选用30 μmol·L-1培养24 h为造模条件;当SDG浓度为20 μg·mL-1时,GES-1细胞活力与MNNG组相比差异无统计学意义,而SDG浓度为50、100、125、150 μg·mL-1时,与MNNG组相比细胞活力显著升高(P<0.01),见图8B,结果表明SDG浓度为50、100、125 μg·mL-1时可以提高细胞活力并对GES-1细胞无明显损害,而浓度为150 μg·mL-1时细胞活力略有下降,故选取50、100、125 μg·mL-1作为给药组浓度,进行后续实验。

注:图8 MNNG和石丹颗粒对细胞活力的影响Fig.8 Effects of MNNG and Shidan Granules oncell viability

2.2.2 石丹颗粒对IL-6、TNF-α含量的影响 经ELISA检测分析,结果表明与对照组相比,MNNG组IL-6、TNF-α含量明显升高(P<0.01);经SDG(50、100、125 μg·mL-1)干预后,与MNNG组相比,IL-6、TNF-α含量明显下降(P<0.01),见图9。结果表明,SDG能降低炎症因子分泌。

注:图9 石丹颗粒对IL-6、TNF-α的影响Fig.9 Effect of Shidan Granules on IL-6、TNF-α

2.2.3 石丹颗粒对核心靶基因表达的影响 经qPCR检测分析,与对照组相比,MNNG组Akt1的mRNA表达水平明显下降(P<0.01),而IL-6、TNF-α的mRNA表达水平明显上升(P<0.01);经SDG(50、100、125 μg·mL-1)干预后,与MNNG组相比,Akt1的mRNA表达水平明显上升(P<0.01),而IL-6、TNF-α的mRNA表达水平明显下降(P<0.01),见图10。结果表明,SDG能明显调节核心靶基因表达水平。

注:图10 石丹颗粒对核心靶基因mRNA表达的影响Fig.10 Effect of Shidan Granules on mRNA expression of core target genes

2.2.4 石丹颗粒对核心靶蛋白表达的影响 经Western blot检测分析,与对照组相比,MNNG组p-Akt1蛋白表达水平明显下降(P<0.01),而IL-6、TNF-α蛋白表达水平呈上升趋势(P<0.01);经SDG(50、100、125 μg·mL-1)干预后,与MNNG组相比,p-Akt1蛋白表达水平明显上升(P<0.01),而IL-6、TNF-α蛋白表达水平明显下降(P<0.01),见图11。结果表明,SDG能显著调节核心靶点的蛋白表达水平。

注:图11 石丹颗粒对核心靶蛋白表达的影响Fig.11 Effect of Shidan Granules on expression of core target proteins

本研究基于拓扑参数分析发现槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元等为SDG治疗CAG的重要活性成分,其中前两者分别来自本方君药黄芪、党参,豆甾醇来自党参和土茯苓,常春藤皂苷元来自黄芪和茯苓。槲皮素和木犀草素均为天然的黄酮类化合物,二者都具有抗炎、抗氧化、抗癌以及抗病毒活性等药理作用[20-21]。文献报道,黄酮类化合物对预防胃癌有明显疗效,被证明是一种可行的替代疗法[22]。近年来有研究表明,槲皮素可以通过抑制NF-κB信号通路和AP-1信号通路减轻TNF-α诱导的细胞凋亡和炎症[23-24],还能够通过介导IRF8/IFN-γ改善幽门螺杆菌感染诱导的慢性萎缩性胃炎[25]。木犀草素通过抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2等多种促炎因子,进而参与调控炎症反应[26]。豆甾醇和常春藤皂苷元二者近年来常被作为潜在的抗癌药物,对各类肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移有良好的抑制作用[27-28]。有研究报道,豆甾醇通过调节Akt/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡和自噬[29];常春藤皂苷元通过PI3K/Akt信号通路抑制HGC-27细胞的上皮间质转化从而发挥抗胃癌作用[30]。以上提示SDG可能通过参与调节炎症反应、调控肿瘤细胞,以促进CAG患者病情趋于好转,延缓或抑制其发生癌变。

针对“石丹颗粒-慢性萎缩性胃炎”82个共同靶点进行分析,基于Degree值推测IL-6、Akt1、TNF为SDG治疗CAG的核心靶点。IL-6为促炎细胞因子家族的成员之一,可通过多种途径参与炎症反应,在炎症性疾病治疗中发挥重要作用[31-32]。近年来研究表明,在CAG的发生和发展中,IL-6不仅参与炎症反应和组织损伤过程,而且还可以促进癌细胞转移和侵袭[33-35]。Akt1作为Akt亚型之一,有研究发现,在CAG模型中,Akt1主要通过PI3K/Akt信号通路负责参与调控细胞增殖、分化等生物学过程,Akt1的激活能够促进上皮细胞增生修复,影响炎症反应[36]。TNF是一种调节细胞因子,能够促进炎症因子的释放,诱发凋亡的产生[37]。有研究报道,在胃炎患者的胃黏膜组织中,TNF-α的表达明显增高。细胞实验发现,TNF-α可以激活IL-6/STAT3信号通路诱导细胞间质转化,进而导致胃癌的发展[38-41]。利用Autodock对槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元与核心靶点进行分子对接,验证其结合能力,结果显示对接良好,进一步说明槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元可能主要通过IL-6、Akt1和TNF等靶点发挥治疗CAG的作用。GO和KEGG富集分析结果亦显示,SDG主要通过调节炎症反应从而改善CAG。

为证实网络药理学预测结果,本研究选择IL-6、TNF-α和Akt1核心靶点进行细胞实验验证,结果表明SDG中槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元等主要活性成分可能通过调节IL-6、Akt1和TNF-α等关键靶点发挥作用,降低IL-6和TNF-α炎症因子水平,缓解炎症反应,从而改善CAG抑制其向胃癌发展,与网络药理学预测结果基本一致。

综上,本研究基于网络药理学推测SDG中槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元等主要活性成分通过作用于IL-6、TNF-α和Akt1等核心靶点调控IL-17、TNF-α和PI3K-Akt等信号通路,参与细胞凋亡与增殖、氧化应激等生物学过程,从而发挥抗炎、抗肿瘤作用;并通过细胞实验初步证实网络药理学预测结果,为进一步研究SDG治疗CAG的分子作用机制提供理论依据和实验基础。

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