龚 浪，孙英硕，许润达，陈熊男，高 琦，黄 钊，陈孝军，郑佳琛，郭彦辰，吴芮霞，曾凡亮，王 衡，张桂红
(华南农业大学兽医学院,广东 广州 510642)
非洲猪瘟(African swine fever)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、热性、出血性和高度接触性的烈性传染病，可感染不同品种和各个年龄阶段的猪，感染致死率高达100%。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health)将其列为A类动物疫病，也是法定报告动物疫病。ASFV是一种囊膜病毒，基因组为双链DNA，大小为170～192 kb[1]，其在全球的蔓延，特别是在中国的暴发，严重威胁了全球猪肉生产和食品安全[2]。ASFV主要通过直接接触猪只及其分泌物或间接接触垫料、饲料、车辆等传播[3]。猪群一旦感染ASFV，只能通过扑杀和彻底消毒来阻断ASFV的传播。目前非洲猪瘟既无有效疫苗用于预防，也无有效药物用于治疗，只能通过严格的生物安全手段进行防控。因此，充分了解ASFV的生物学特性，对于合理制定非洲猪瘟的防控措施极为重要[4]。
ASFV对外界环境的抗性研究不仅有助于了解该病毒的生物学特性，对疾病的防控也意义重大。早在1921年，有研究指出ASFV对高温和干燥等物理因素具有极强的抗性[5]。消毒剂的使用是猪场提高生物安全、防控非洲猪瘟的重要手段[6]。理想的消毒剂应是高效、作用时间长、无毒性、不受环境因素影响、作用范围广[7]，但消毒剂受外界环境因素的影响较大，如有机物、温度等因素都会影响其消毒效果[8]。无论是物理性消毒还是化学性消毒都能够将病原微生物降低到一定程度，使消毒的受体不再是传染源[9]。
ASFV传入我国后，在基因组的重要位点发生了一定的插入、缺失和替换，这可能会导致其生物学特性的改变。因此，全面了解ASFV对各种物理和化学因素的耐受性很有必要，本研究利用C频段紫外线(UVC)照射、室内室外干燥、阳光暴晒和各种化学消毒剂处理ASFV，通过猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages，PAM)的红细胞吸附(Hemadsorption，HAD)试验和qPCR试验，测定ASFV的红细胞吸附特性和基因拷贝数，系统地评估各种常见物理因素和化学消毒剂对ASFV活性杀灭和核酸降解的影响，为猪场临床防控非洲猪瘟提供理论支持。
PAM由华南农业大学张桂红教授课题组(本课题组)统一分离制备，保存于液氮中；
ASFV毒株GZ201801(MT496893.1)由本课题组分离，保存于华南农业大学动物生物安全三级实验室。
DNA抽提试剂盒为北京索莱宝科技有限公司产品；
磷酸盐缓冲液(PBS)、RPM I-1640、胎牛血清(FBS)和含0.25%(w)EDTA的胰酶购自美国GIBCO公司；
高保真DNA聚合酶、不同大小的DNA marker为日本TaKaRa公司产品；
Probe qPCR M ix为天根生物有限公司产品；
细胞染料台盼蓝购自Invitrogen公司；
细胞冻存液购自集美赛公司；
氯胺酮、咪达唑仑、阿托品和戊巴比妥钠均为上海恒远生物科技有限公司产品；
CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；
其他常用试剂均购自生工生物工程(上海)有限公司。
用肝素钠抗凝管收集新鲜的猪外周血，按照1∶8的体积比加入适量的PBS，轻轻上下颠倒数次后，2000 r/min 离心5min，弃上清液，重复洗涤3～4次，最后一次弃上清液后，用与最初取血体积相等的PBS重悬红细胞沉淀，即为制备的红细胞悬液(红细胞体积分数约为2%)，最好现用现配，若4℃保存，时间不应超过3 d，一旦出现溶血，便不得使用。
利用引物设计软件设计ASFV P72基因的qPCR引物，具体引物信息[10]见表1。
表1 ASFV P72基因和猪β-actin基因的qPCR引物与探针Table 1 Primer and probe for qPCR of ASFV P72 gene and porcine β-actin gene
qPCR的反应体系与反应物均按照TIANGEN的快速定量PCR试剂(探针法)说明书配置。qPCR在LightCycle®96检测系统上进行，PCR反应程序：95℃预变性1min；
95℃变性5 s，60℃退火、延伸各15 s，共40个循环。qPCR完成后，通过相应的配备软件分析各个样品的Ct。
将ASFV病毒溶液分别用纯水、生理盐水和猪血液(动脉血和静脉血)稀释至病毒含量为104HAD50/m L(HAD50为半数红细胞吸附量)，于不同温度(4、25、37℃)条件下静置。每天进行样品回收，通过HAD试验判定病毒是否存活，每个处理3次重复。
将含有ASFV的含FBS(φ为50%)细胞培养液或者含有ASFV的细胞培养液，用PBS将病毒含量稀释为105HAD50/m L，封装于直径33mm平皿中，每个平皿加500μL培养液，在UVC强度为110～120μw/cm2条件下进行照射处理，处理时间分别为30、60、90、120、150、180、210min和0、3、6、9、15、20、30、40、50、60min。UVC处理完成后，将50μL样品加入预先铺有PAM的96孔细胞培养板中，通过HAD试验判定不同UVC照射时间对病毒的影响，同时通过qPCR检测UVC对ASFV核酸的影响。每个处理3次重复，结果用平均值±标准差表示。
将含有ASFV的细胞培养液，用PBS稀释至病毒含量为105HAD50/m L，封装于直径33mm平皿中，平皿盖子上钻有3个直径2mm的小孔，每个平皿加200μL，在生物安全柜中快速通风干燥。然后分别置于室内和模拟的室外环境处理，记录环境温度。分别在干燥0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0 d后，取50μL样品加入预先铺有PAM的96孔细胞培养板中，通过HAD试验判定不同干燥程度对病毒的影响。同时，通过qPCR试验检测干燥对ASFV核酸的影响，结果用平均值±标准差表示。并且，测定不同干燥条件对ASFV滴度变化的影响。
将含有ASFV的细胞培养液，用PBS稀释至病毒含量为105HAD50/m L，封装于EP管中，每管加50μL，然后挑选有阳光照射的地方进行暴晒处理。记录UVC强度、空气温度、阳光直射温度，分别在处理0、5、10、15、20、30、35、50和60min后，将50μL样品加入预先铺有PAM的96孔细胞培养板中，通过HAD试验判定不同暴晒时间对病毒的影响，通过qPCR试验检测阳光暴晒对ASFV核酸的影响，并且测定阳光暴晒对ASFV滴度的影响。
分别选取不同类别不同有效成分含量的消毒剂：甲醛(醛类，甲醛体积分数37%～40%)；
柠檬酸(酸类，柠檬酸体积分数≥99.5%)；
烧碱(碱类，氢氧化钠体积分数≥95%)；
卫可(过氧化物类，过硫酸氢钾中有效氯体积分数≥10%)；
84消毒液(氯制剂类，有效氯体积分数5%左右)；
漂白粉(氯制剂类，次氯酸钙中有效氯体积分数30%～35%)；
二氯异氰尿酸钠(氯制剂，有效氯体积分数30%)；
百毒杀(季铵盐类，癸甲溴铵体积分数≥10%)；
戊二醛(醛类，戊二醛体积分数20%)；
安灭杀(戊二醛和季铵盐混合类，戊二醛、季铵盐体积分数分别为15%、10%)；
复合酚(酚和醋酸混合类，酚体积分数41%～49%、醋酸体积分数22%～26%)；
戊二醛癸甲溴铵溶液(戊二醛和癸甲溴铵混合类，戊二醛体积分数5%、癸甲溴铵体积分数5%)；
复方戊二醛(戊二醛和苯扎氯铵混合类，戊二醛体积分数15%、苯扎氯铵体积分数10%)和碘酸混合溶液(碘和磷酸混合类，碘体积分数3%、磷酸体积分数30%)。按照各消毒剂的使用说明推荐的比例进行稀释。随后，将各消毒剂与病毒含量为105HAD50/m L的ASFV病毒液按照体积比1∶1混合，室温条件下分别作用15和30min。最后，将样品稀释至对细胞安全范围，再加入预先铺有PAM的96孔细胞培养板中，通过HAD试验判定不同消毒剂及其不同作用时间对病毒的影响。
分别选取不同类别消毒剂：季铵盐类、复合酚、过硫酸氢钾、戊二醛和碱类，将各类别消毒剂用PBS稀释，并与等体积105HAD50/m L的病毒溶液在预定温度(4、25、37℃)处理后混合，作用5和15min后，将样品稀释至对细胞安全范围，再加入预先铺有PAM的96孔细胞培养板中，通过HAD试验判定在不同温度条件下不同消毒剂对病毒杀灭效果的影响。
分别选取不同类别消毒剂：季铵盐类、复合酚、过硫酸氢钾、戊二醛和碱类，将各类别消毒剂用含不同含量FBS的PBS稀释，并与等体积105HAD50/m L的病毒溶液混合。混合后，消毒剂终浓度达到预期稀释浓度，FBS体积分数分别为0、10%和30%，作用15和30min后，将样品稀释至对细胞安全范围，再加入预先铺有PAM的96孔细胞培养板中，通过HAD试验判定不同含量FBS对不同消毒剂杀灭病毒效果的影响。
取各种理化因素与消毒剂处理完成的病毒溶液50μL，加入预先铺有PAM的96孔细胞培养板中，每个样品1孔，37℃孵育2 h后，弃去病毒液，加入细胞培养液，于37 ℃、5%(φ)CO2培养箱培养4 d后，加入新鲜配置1%(φ)猪红细胞溶液40μL，于37℃、5%(φ)CO2培养箱继续培养24 h后在显微镜下观察是否出现红细胞吸附。若出现红细胞吸附，则表明有ASFV的存在，标记为“+”；
若无红细胞吸附，则表明无ASFV的存在，标记为“−”；
结果不确定或3次重复结果不一致，则标记为“±”。
取ASFV在PAM细胞上增殖培养后的细胞培养上清液，测定病毒滴度为106HAD50/m L。按照试验需求，将病毒滴度调整为105HAD50/m L，放置于−80℃保存。
ASFV在不同条件下静置处理后，用HAD试验检测病毒存活情况，结果显示：室温(25℃)条件下，ASFV的感染力在猪静脉血中能保持14 d，在猪动脉血中能保持30 d，在纯水中能保持22 d，在生理盐水中能保持60 d以上；
将含ASFV的纯水和生理盐水置于不同温度(4、25、37℃)条件下，温度越低，ASFV感染力保持时间越长(表2)。
表 2 ASFV在不同条件下静置的存活天数Table2 Survival days of ASFV standing under different conditions d
在强度为110～120 μw/cm2的UVC作用下，30 min及以上时间的照射即可使含FBS细胞培养液或细胞培养液中的ASFV完全失活，失去感染细胞的能力，表明ASFV对UVC敏感，含FBS细胞培养液中的ASFV和细胞培养液中的ASFV对UVC敏感性相似(表3)。此外，通过qPCR试验分析UVC对ASFV核酸的影响，结果显示：UVC能够降低ASFV对细胞的感染能力，高强度的UVC能够破坏ASFV遗传物质，UVC作用时间越长，qPCR检测得到的Ct越高，对ASFV核酸的降解越严重(表3)。
表3 UVC照射对含FBS细胞培养液和细胞培养液中ASFV感染力的影响Table 3 Effect of UVC irradiation on ASFV infection in FBS-containing cell supernatant and cell supernatant
在试验环境条件下，模拟室外环境温度为28～32℃，室内环境温度为25～26℃。在模拟的干燥室外环境，ASFV在1.5 d后失活，而在干燥的室内环境，2.5 d后失活；
其病毒感染力也随处理时间的延长逐渐下降，室外干燥1.5 d、室内干燥2.5 d后，ASFV完全失活(表4)。结果表明ASFV对干燥敏感，在干燥环境下快速失去感染细胞的能力。
通过qPCR试验分析干燥对ASFV核酸的影响，结果显示：在短期内，室外和室内干燥环境下，检测出的Ct相近，且变化不明显，表明不论是室内还是室外的干燥环境对ASFV遗传物质的影响均不明显(表4)。
表4 室外和室内干燥环境对ASFV感染力的影响Table 4 Effects of outdoor and indoor drying environment on ASFV infection
试验环境条件下，记录到UVC强度为25～30 μw/cm2、空气温度为32 ℃、阳光直射温度为38～40 ℃。ASFV的感染力随处理时间的延长而逐渐降低，30min及以上时间的暴晒处理，都能使ASFV完全失活，失去感染细胞的能力(表5)。此外，通过qPCR试验分析培养液中ASFV核酸，Ct变化不明显，表明阳光暴晒对液体水环境中ASFV遗传物质的影响不明显(表5)。
表5 阳光暴晒对细胞培养液中ASFV感染力的影响Table 5 Effects of sun exposure on ASFV infection in cell supernatant
通过HAD试验验证各种类别的代表消毒剂对ASFV的杀灭效果，按照推荐的稀释倍数，甲醛、烧碱、84消毒液、漂白粉、二氯异氰尿酸钠、安灭杀、复合酚、戊二醛癸甲溴铵溶液和复方戊二醛都能使ASFV完全失活，柠檬酸稀释100倍、卫可≤200倍、百毒杀≤300倍、戊二醛≤2 000倍能使ASFV完全失活，失去吸附红细胞的能力(表6)。当戊二醛稀释倍数为1∶5 000，作用时间必须≥30 min才能使ASFV完全失活。综上，除碘酸混合溶液外，各类别消毒剂都能有效杀灭ASFV，且消毒效果随消毒剂浓度的提高和消毒时间的延长而增强。
表6 消毒剂对ASFV红细胞吸附能力的影响Table 6 Effects of disinfectants on ASFV heMADSorption capacity
季铵盐类消毒剂(二癸基二甲基氯化铵体积分数≥10%)对ASFV的杀灭作用受温度影响不明显(图1a)；
复合酚(酚体积分数为41%～49%、醋酸体积分数为22%～26%)，过硫酸氢钾(有效氯体积分数≥10%)，戊二醛(戊二醛体积分数为20%)和碱类(碱质量分数约15%)4种消毒剂对ASFV的杀灭效果均受温度影响(图1b～1e)。随着温度降低，消毒剂需要提高作用浓度或者延长作用时间才能起到完全杀灭ASFV的效果。综上，温度严重影响消毒剂对ASFV的杀灭效果，低温不会直接使消毒剂失效，但在低温条件下，消毒剂的作用会减弱，在相对较高的温度条件下，消毒剂的作用显著增强。
图1 温度对5种消毒剂杀灭ASFV的影响Fig.1 Influence of temperature on the ASFV inactivation effect of five kinds of disinfectants
季铵盐类、复合酚、过硫酸氢钾、戊二醛和碱类5种消毒剂对ASFV的杀灭效果均受FBS含量影响；
随着FBS含量升高，消毒剂需要提高作用浓度或者延长作用时间才能完全杀灭ASFV(图2)。综上，有机物的存在削弱了消毒剂对ASFV的杀灭作用；
有机物含量越高，消毒剂的作用越弱。
图2 不同体积分数FBS对5种消毒剂杀灭ASFV的影响Fig.2 Influence of FBS with different volume fractions on the ASFV inactivation effect of five kinds of disinfectants
UVC是一种波长为200～280 nm的紫外线。微生物的DNA、RNA和核衣壳的紫外吸收峰最高为254～257 nm，当微生物吸收紫外线时，其DNA链、核酸和蛋白质的交联断裂。UVC会相应地破坏核酸的生物活性，导致微生物死亡。紫外线照射具有很强的消杀作用，可通过形成吡啶二聚体来灭活多种微生物，如病毒、细菌、原生动物、真菌、酵母和藻类等[11]。本研究发现在110～120μw/cm2的UVC照射强度下，ASFV不管是在含FBS的细胞培养液中，还是在细胞培养液中都可被灭活，丧失吸附猪红细胞的能力，照射30 min及以上，可使ASFV完全灭活。同时，UVC照射具有很强的降解ASFV核酸的能力；
qPCR检测结果显示，经长时间110～120μw/cm2UVC照射后，无论是在含FBS的细胞培养液还是在细胞培养液中，ASFV DNA的Ct均会升高，说明核酸浓度降低。前期研究发现3 600μw/cm2紫外线照射强度可在3 s内完全灭活ASFV[12]；
并且，在3 600μw/cm2强度的紫外线照射条件下，细胞培养液中ASFV的核酸在60 s内即可被破坏。可见，紫外线强度够大，能够瞬间灭活ASFV。UVC是一种物理消毒方法，在足够强度的照射下，水中的微生物可以在短时间内被有效灭活。污水是养殖场生物安全最大的威胁之一，而灭活水中的微生物是防止非洲猪瘟传播的重要途径。
相对于其他病毒，ASFV对不同传播介质均有极强的抗性。本研究中ASFV在不同条件下静置处理的结果表明，ASFV在猪血中能存活14～30 d，在纯水中能存活22 d，在生理盐水中能存活60 d以上。如果静置温度降低，ASFV的存活时间将会更长，可见温度是影响ASFV存活的重要因素，当温度升高到70 ℃以上时，ASFV可在10 s内被灭活[13]。结合本研究中ASFV对干燥和阳光暴晒的反应：ASFV在干燥的室外环境，1.5 d后失活，而在干燥的室内环境，2.5 d后失活；
ASFV在暴晒30min后完全失活。由此可以得到启发，在猪场管理中，应时刻保持猪舍的通风、干燥，有条件的情况下要尽可能地增加日照时长。这对于非洲猪瘟的防控和猪场生物安全水平的提高都有重要意义。
消毒是阻止猪场传染性疾病发生、传播和蔓延的重要手段之一。本研究通过HAD试验比较常用的醛类(甲醛、戊二醛)、酸类(柠檬酸)、碱类(烧碱)、氧化剂类(卫可)、季铵盐类(百毒杀)、氯制剂类(84消毒液、漂白粉和二氯异氰尿酸钠)和复合型消毒剂(安灭杀、复合酚、复方戊二醛、戊二醛癸甲溴铵溶液、碘酸混合溶液)对ASFV的杀灭效果，结果显示，除碘酸混合溶液外，所有的消毒剂都可有效杀灭ASFV，使其丧失吸附红细胞的能力，与前人的研究结果[14-15]相符。在推荐浓度和一定时间的作用下，绝大部分消毒剂可以完全灭活ASFV；
这对生产中消毒剂种类、稀释浓度和作用时间的选择具有指导意义。针对所要杀灭的微生物的特点，选择合适消毒剂是消毒工作成败的关键。人员、车辆消毒应选择刺激性小、作用时间较快的消毒剂，如过硫酸氢钾复合物粉、戊二醛类；
空栏、消毒池(盆)消毒应选择作用持续时间长、消毒灭活范围广的消毒剂，如二氯异氰尿酸钠粉(消毒威)、复合酚(菌毒涤)；
洗手、人员体表消毒应选择刺激性小的消毒剂，如过硫酸氢钾复合物粉、季铵盐类等。ASFV对各种外界条件都有很强的抵抗力，可在粪便和血液中较长时间保持传染性，在有机物存在的情况下，病毒可能更稳定，存活时间更长。消毒剂的使用受外界条件的影响很大，如作用时间、温度、是否含有机物等，都会影响消毒效果[16-17]。本研究结果表明，有机物的存在会影响消毒剂对ASFV的灭活效果，有机物含量越高，消毒剂的灭活效果越弱。此外，消毒剂对ASFV的灭活效果随着温度的升高而增加。因此，为了更科学、高效地使用消毒剂，我们建议在使用消毒剂之前应先将物体清洗干净，以减少物体表面的干扰物质。在对猪场表面含有血液、粪便等有机物的区域进行消毒时，为了完全灭活病毒，应适当增加消毒剂的浓度，延长作用时间。
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