体外培养外周血来源NK细胞纯度影响因素及其预测模型的构建

葛 瑶,王春燕,刘 琦,郭 静,熊 兵,刘淑鹏,程忠平

自然杀伤(natural killer,NK)细胞是一群CD3-CD56+的先天免疫淋巴细胞,可以快速识别并杀伤病变细胞[1]。近几年国内外关于NK细胞回输所开展的临床实验有很多,研究的疾病主要包括血液系统肿瘤和实体瘤[2]。用于临床回输的NK细胞来源广泛,包括外周血来源、脐带血来源和细胞系来源的NK细胞[3]。其中,外周血来源的NK细胞获取简单,操作方便。外周血来源的NK细胞培养方法主要有饲养层培养法和因子激活法。其中,饲养层培养法虽然其扩增NK细胞的作用十分显著,但是K562细胞作为异源性细胞,存在一定的输入安全隐患[4]。因子激活培养法是通过使用含有白细胞介素(interleukin, IL)-2等细胞因子的培养基激活扩增NK细胞,安全性较高,但此NK细胞纯度存在较大的个体差异,严重影响后续治疗效果[5]。为了对体外培养的NK细胞纯度进行预测,该研究探讨了影响NK细胞体外培养纯度的相关因素,构建一种预测NK细胞纯度的模型,为后续临床诊疗方案的制定提供理论依据。

1.1 捐献者资料收集2020年1月—2022年3月在上海市第十人民医院门诊部体检并同意捐赠外周血用于NK细胞体外培养的93例健康人群的信息,其中男性23例,女性67例;年龄20～73(52±9.16)岁。本研究中93例健康捐献者无家族病史以及无传染病、心脑血管疾病、肝肾疾病或免疫学疾病,同时剔除其他相关人群,如吸烟、酗酒、药物滥用史、怀孕。本研究经上海市第十人民医院医学伦理委员会批准(批号:20K180),患者签署知情同意书。

1.2 NK细胞的体外培养及纯度检测按照药品生产质量管理规范(good manufacturing practice of medical products, GMP)要求,抽取捐献者40～50 ml的外周血,通过密度梯度离心法获取外周血单个核细胞和血浆,使用添加100 IU/ml激活因子的培养基和10%的自体血浆重悬细胞(细胞原始密度为2×106/ml)。培养第0～7天,使用添加激活因子的培养液激活细胞;培养第8～14天使用添加200 IU/ml IL-2的扩增培养液扩增细胞。培养第14天时,采用流式细胞术检测免疫分子CD3、CD56的表达情况。通过检测CD3-CD56+的细胞占总细胞数的百分比,分析NK细胞纯度。

1.3 临床指标收集捐献者外周血采样前的检查数据,共138项指标。① 血常规指标包括:红细胞(red blood cell,RBC)、血红蛋白、红细胞压积、红细胞平均体积、平均血红蛋白量、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度(red blood cell distribution width,RDW)、红细胞分布宽度标准差(standard deviation of red blood cell volume distribution width,RDW-SD)、白细胞计数、中性粒细胞数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比(percentage of lymphocytes,LY%)、嗜酸粒细胞百分比(percentage of eosinophils,EOS%)、嗜碱粒细胞百分比、嗜酸粒细胞数(number of eosinophils,EOS)、嗜碱粒细胞数、单核细胞百分比、单核细胞数、血小板计数、血小板平均体积、血小板压积、血小板分布宽度(width of platelet volume distribution, PDW)。② 生化指标包括:丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、总蛋白、球蛋白、葡萄糖(glucose, Glu)、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、钾、钠、氯、三酰甘油、尿酸、尿素氮、肌酐(creatinine, Cr)。③ 其他指标包括:凝血功能指标、淋巴细胞亚群(T细胞、B细胞和NK细胞)、甲状腺功能指标、免疫抗体指标和肿瘤标志物指标。

1.4 统计学处理将93例捐献者的体检指标及NK细胞纯度信息随机排列,抽取77例作为训练集,16例作为测试集。对训练集中138项临床检测指标进行统计,按照缺失值占比超过0.4的原则进行删除。使用Pearson相关性检验,将剩余的63项临床指标纳入单因素分析,筛选出影响NK细胞纯度的变量。多因素分析采用step AIC函数进行逐步回归,筛得变量重新建立回归模型。在测试集中,分析NK index模型预测纯度与真实纯度的相关性;再对训练集中的自变量进行二分类处理,以NK细胞实际纯度的中位值为截断点,分高低两组,分析训练集和测试集受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)下面积(area under the curve,AUC)。数据采用R语言、Prism 8.0和Excel软件进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 NK细胞纯度分布NK细胞纯度流式检测结果显示,93例健康捐献者中,2例捐献者NK的细胞纯度在0.8以上,17例捐献者NK细胞的纯度分布在0.6～0.8,36例捐献者NK细胞的纯度在0.4～0.6之间,26例捐献者NK细胞的纯度分布在0.2～0.4之间,12例捐赠者NK细胞的纯度小于0.2。以上结果说明在相同的因子诱导条件下,NK的细胞纯度存在个体间的差异。

2.2 影响NK细胞纯度的单因素分析单因素分析结果显示,年龄、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW与NK细胞体外培养纯度存在统计学意义(P<0.05),见表1。散点图(图1)进一步分析了年龄、T3、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW与NK细胞纯度之间的线性关系,除了LY%与NK细胞纯度之间存在负相关线性关系,其他指标均与NK细胞存在正相关线性关系。

图1 临床检测指标与NK细胞纯度的线性关系图

表1 影响NK细胞纯度的临床检测指标单因素分析

2.3 影响NK细胞纯度的多因素分析及预测模型的建立多因素变量回归分析显示,RDW-SD(P<0.001)、PDW(P<0.001)、Glu(P<0.001)和T3(P<0.1 )为影响NK细胞纯度的关键变量,并以这4个变量重新建立回归模型,最终建立预测模型NK index=-164.557+2.544×RDW-SD +3.730×PDW+4.389×Glu+10.237×T3(R2=0.494,P<0.05)。

2.4 NK index模型预测值与实际值的相关分析在测试集中,对NK index模型的预测纯度与真实纯度做线性相关分析(R=0.725,P=0.001),说明NK index模型预测纯度与真实纯度之间存在较强的统计学意义。见图2。

图2 NK index 模型预测值与真实值的线性关系图

2.5 NK index模型在训练集和测试集中ROC曲线分析利用AUC分析NK index模型对于NK细胞纯度高低的预测能力。结果显示,训练集中NK index模型的AUC为0.815(95%CI=0.753～0.915),见图3;测试集中NK index模型的AUC为0.938(95%CI=0.82.41～1.00),见图4,说明NK index模型对NK细胞纯度高低有较好的预测价值。

图3 训练集中NK index模型的ROC曲线

图4 测试集中 NK index模型的ROC曲线

在NK细胞的临床回输中,通常需要在体外扩增出大量高纯度的NK细胞。使用因子诱导法培养NK细胞时,NK细胞的纯度和数量总是存在较大的个体间差异。通过收集捐献者的外周血进行14 d的体外因子刺激培养,统计结果显示NK细胞纯度在个体间差异较大。为了找到影响NK细胞纯度的指标,该研究收集了常见的临床指标,通过对纳入的68项临床指标进行单因素分析,结果显示,年龄、T3、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW与NK细胞纯度有相关性。研究[6]表明,年龄的增加会降低固有免疫系统功能,但同时也会增加疾病的易感性。与成人相比,老年人的促炎细胞因子、肿瘤坏死因子和IL-6更高,NK细胞的数量也呈现出增加的趋势。本研究显示,年龄的增加也会提高NK细胞纯度,说明年龄的增加可以促进促炎因子的升高,进而增加NK细胞纯度。T3为主要发挥生物活性的甲状腺激素,在固有免疫系统中具有促炎作用,可以促进NK细胞的增殖和活性[7]。本研究显示T3在数值较高时,对应的NK细胞纯度值也较大,说明甲状腺原氨酸可能会促进NK细胞相关受体的活化与表达。RDW为红细胞大小的变异系数,RDW-SD为红细胞分布曲线宽度的实际测量值,两者被广泛应用于炎症性疾病的临床检验,与炎症标志物密切相关,如C反应蛋白、IL-6和肿瘤坏死因子。目前很多学者提出RDW可以作为预测多种疾病的参数,RDW越高,预后越差[8]。Lochowski et al[9]研究提示,RDW-SD>43时,可以作为非小细胞肺癌预后不良的独立因素。在本研究中,RDW和RDW-SD与NK细胞纯度呈现正相关,提示RDW和RDW-SD的升高会促进体内炎性因子的升高,进而促进NK细胞数量和纯度的提高。血清Cr作为最常用的肾脏功能的生物学标志物,用来评估慢性肾病[10]。研究[11]表明,在慢性肾病的研究中,轻度尿毒症患者可以通过增加NK细胞的百分比来影响NK细胞的功能。本研究显示Cr与NK细胞纯度呈现正向相关性,提示Cr作为NK细胞纯度的预测因素可能具有重要意义。Glu是一种关键的细胞燃料, 通过分解可以产生能量分子,促进NK细胞的增殖和代谢[12],因此推测Glu通过产生能量分子,进而提高NK细胞纯度。PDW被定义为血小板大小异质性的指标, 作为血栓炎症条件的风险预测因子的有效性[13],可能会促进NK细胞的增殖和活性作用,在本研究结果中,PDW可能通过促进NK细胞的增殖和活性,进而提高NK细胞的纯度。淋巴细胞和嗜酸性粒细胞都属于白细胞的一部分。研究[14]表明LY%的高低与病情严重程度相关,通常认为人体抵御外来病毒的侵袭主要依赖T淋巴细胞介导的细胞免疫作用,说明LY%的升高可能主要与T淋巴细胞的激活有关。在本研究结果中,LY%与NK细胞纯度数值呈负相关,说明T淋巴细胞的大量激活可能会抑制NK细胞的体外增殖。有研究[15]表明嗜酸粒细胞主要合成、储存和分泌细胞因子、趋化因子和生长因子,说明嗜酸粒细胞可能促进NK细胞的激活和扩增。在本研究结果中,嗜酸粒细胞与NK细胞纯度呈正相关,推测嗜酸粒细胞可能促进NK细胞的激活和扩增来提高NK细胞纯度。

通过对多因素变量的分析,筛选出RDW-SD、PDW、Glu和T3作为NK细胞纯度的预测因素,最终建立了能够较好预测NK细胞纯度的NK index模型。对于纯度不能达到临床回输要求的个体,可以提前告知患者,从而大大缩减了培养的成本。因此,获取临床可用的、简便有效的指标构建NK细胞纯度预测模型具有潜在的科研和社会应用价值。

本研究通过收集常见的临床指标来分析影响NK细胞纯度的因素,但由于该模型还存在一些不足:由于缺少免疫相关的指标,如IgM、IgG、干扰素和肿瘤坏死因子等。本研究对捐献者的免疫状态描述不够全面,后续可进一步探索以免疫学指标为变量所构建模型的预测价值。因此,需要进一步扩大样本量和临床检测指标进行研究,以得到更理想的预测模型。

猜你喜欢捐献者纯度粒细胞单采血小板捐献者献血不良反应及防范措施分析智慧健康(2021年22期)2021-10-18经方治疗粒细胞集落刺激因子引起发热案1则中国民间疗法(2021年14期)2021-08-30退火工艺对WTi10靶材组织及纯度的影响粉末冶金技术(2021年3期)2021-07-28色彩的纯度童话世界(2017年29期)2017-12-16间接滴定法测定氯化铜晶体的纯度中学生数理化·高二版(2016年6期)2016-05-14嗜酸性粒细胞增多综合征的治疗进展医学研究杂志(2015年3期)2015-06-10误诊为嗜酸粒细胞增多症1例分析中国当代医药(2015年21期)2015-03-01对氯水杨酸的纯度测定应用化工(2014年11期)2014-08-16岳阳地区血小板捐献者HPA1～17,HLA-A和B基因多态性研究现代检验医学杂志(2014年3期)2014-02-02浅谈如何减少造血干细胞捐献者的流失长江大学学报(自科版)(2013年15期)2013-03-31