肌球蛋白重链在不同年龄间歇性外斜视患者内直肌中的表达

李芳 龙登虹 邓斯元 吴挺飞

斜视是发育正常儿童中最常见的眼部问题之一。斜视的患病率因地区而异，从日本的0.06%到中国的5.65%不等［1-3］，大约48%～92%的外斜视患者患有间歇性外斜视。间歇性外斜视患者虽具有正常眼位和双眼感觉功能，但当疲倦、注意力不集中或注视远处时，眼睛会出现发散性偏差，且伴有立体视力丧失，长此以往将导致视觉混乱或视力丧失。目前间歇性外斜视的病因尚不清楚，但许多因素，包括神经机械因素、融合不足、高调节收敛比、屈光不正和遗传因素等［4］。近年来随着对眼外肌研究的不断深入，发现间歇性外斜视患者眼外肌伴随着病理形态改变与肌力变化。肌球蛋白、肌动蛋白是肌原纤维中负责运动功能的收缩蛋白质，且骨骼肌的收缩特性在很大程度上取决于肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）亚型的组成［5］。本研究通过观察肌球蛋白重链13（myosin heavy chain 13，MYH13）、肌球蛋白重链1（myosin heavy chain 1，MYH 1）、肌球蛋白、肌动蛋白在不同年龄间歇性外斜视患者内直肌中的表达，旨在从组织学的角度探究间歇性外斜视患者年龄与MyHC 的关系，为手术时机的选择提供理论依据。

1.1 研究对象

选取2020 年9 月至2022 年9 月于海南省眼科医院行斜视矫正手术的102 例间歇性外斜视患者为研究对象。纳入标准：①基本型间歇性外斜视符合《美国眼科临床指南（2017 年版）》［6］中的相关标准；
②双眼球运动正常，择期于本院行斜视矫正手术；
③患者或监护人知情并签署同意书。排除标准：①恒定性外斜视；
②合并其他类型的斜视；
③有其他眼部疾病及全身系统性疾病；
④有眼部外伤史或手术史。根据患者年龄分为儿童组（0～6岁）（n=36）、少年组（7～17 岁）（n=35）、青年组（18～40 岁）（n=31）。儿童组男17 例，女19 例，平均年龄（4.36±1.25）岁，平均斜视度（36.57±4.86）△；
少年组男20 例，女15 例，平均年龄（33.19±2.13）岁，平均斜视度（37.31±5.11）△；
青年组男15 例，女16 例，平均年龄（25.34±3.46）岁，平均斜视度（38.60±5.23）△。3 组患者性别、斜视度等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。该研究已获得海南省眼科医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 内直肌的提取与保存

所有患者均接受完整的眼科检查，所有手术均由同一位眼科医生进行。在斜视矫正手术过程中收取患者（3.0～5.0）mm 缩短的内直肌为标本，取一半标本用于免疫组化实验，置于4%多聚甲醛固定液中，石蜡包埋。其余组织样品在液氮中快速冷冻，然后在-80℃环境下保存。

1.2.2 主要仪器与试剂

仪器：RM2245 型石蜡切片机（德国LEICA 公司）；
免疫组织化学笔（福州迈新生物技术开发有限公司）；
BX40 光学显微镜（日本Olympus 公司）；
电热恒温培养箱（青岛博科生物技术有限公司）；
电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；
ABIPRISM 7000 RT-PCR System（美国ABI 公司）。

试剂：鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）、鼠抗人骨骼肌肌球蛋白单克隆抗体（北京中衫金桥生物技术有限公司）；
免疫组化鼠/兔MaxVisionTM 试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；
兔抗GAPDH 单克隆抗体（美国BD 公司）；
羊抗兔IgG 或羊抗小鼠多抗（北京博奥森生物技术有限公司）；
PBS 液（Sigma-Aldrich 公司）；
HRP 标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔的二抗（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.2.3 检测方法

采用免疫组化染色和Western blot 法观察肌动蛋白和肌球蛋白在不同年龄间歇性外斜视患者内直肌中的表达，取各组石蜡包埋完成的一半标本，沿肌肉纵轴层切出厚度约为4 μm 的切片后脱蜡水化，将切片在3%过氧化氢去离子水中孵育10 min 后用PBS 液冲洗，然后将切片置入稀释的一抗中室温下孵育1 h，并在应用二抗之前用PBS洗涤。二氨基联苯胺显色；
自来水冲洗，苏木素轻度复染，自来水冲洗返蓝；
梯度乙醇脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封片，并于光镜下观察免疫组化染色结果。使用荧光显微镜观察并拍照，Image-Pro Plus 6.0 分析图像，取平均光密度值。

Western blot 实验步骤：将另外一半标本组织匀浆、裂解后经煮沸法将蛋白变性，样本行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜后取出硝酸纤维膜用封闭液封闭，4℃过夜。次日加入兔抗人肌球蛋白及肌动蛋白多抗，室温孵育1 h，用TBST缓冲液洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 或羊抗小鼠多抗，室温孵育1 h，加入增强性化学发光显色剂显色，压片、曝光。获得的曝光图片予以扫描保存，其图片中的条带按照灰度值Image J 软件进行分析。

采用BCA 法测定MYH 13、MYH 1 蛋白水平。提取总蛋白，取蛋白于10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，将目的蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，加山羊抗MYH13、MYH 1，兔抗GAPDH，分别加入辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊、鼠抗兔二抗，ECL 染色，胶片曝光，显影，定影，计算MYH13、MYH 1 蛋白表达水平。

实时定量荧光RT-PCR：取1 μg 总RNA 用于逆转录cDNA，得到产物用于下一步的实时定量RT-PCR 反应。使用MyHC 亚型特异性引物和SYBR 绿色PCR 核心试剂，反应体积为24 μL，带有序列检测系统。GAPDH表达量作为内参。将相对转录本丰度归一化为GAPDH的量，并通过2-ΔΔCT方法分析基因表达结果。MyHC13 上游引物序列：5′ 3′GAAGCTCCTGAACTCCATCG，下游引物序列：5′3′GGTCACCAGCTTCTCGTCTC。

1.3 统计学方法

采用SPSS Statistics 21 统计学软件进行分析。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析；
计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。采用Spearman 相关分析肌球蛋白重链表达水平与年龄的相关性。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2.1 3 组患者MyHC、肌球蛋白、肌动蛋白表达水平比较

MYH 13、肌球蛋白、肌动蛋白表达水平：儿童组＞少年组＞青年组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；
3 组MYH 1 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1 与图1、2。

图1 3 组肌动蛋白于肌细胞细胞质中的表达情况（DAB，×200）Figure 1 Expression of actin in the cytoplasm of muscle cells in three groups（DAB，×200）

图2 3 组肌球蛋白于肌细胞细胞质中的表达情况（DAB，×200）Figure 2 Expression of myosin in the cytoplasm of muscle cells in three groups（DAB，×200）

表1 3 组患者MyHC、肌球蛋白、肌动蛋白表达水平比较（）Table 1 Comparison of MyHC，myosin and actin expression levels in three groups of patients（）

表1 3 组患者MyHC、肌球蛋白、肌动蛋白表达水平比较（）Table 1 Comparison of MyHC，myosin and actin expression levels in three groups of patients（）

2.2 MYH 13、肌球蛋白、肌动蛋白表达水平与年龄的相关性

Spearman 性相关分析结果显示，MYH 13、肌球蛋白、肌动蛋白表达水平与年龄呈负相关（r=-0.361、-0.479、-0.262，P均＜0.05）。

间歇性外斜视是临床最常见的外斜视类型。该病发病早，由于融合功能的减退，患者会逐渐丧失双眼视功能并有发展为恒定性斜视的可能。此外，随着年龄增长，间歇性外斜视对患者及其父母生活质量的负面影响将逐渐增大，患者的日常生活及社会活动因此不同程度受限，进而导致一系列社会心理问题。如果不及时治疗，这种早发性视觉发育障碍的负面影响可能会持续到成年期。该病病因尚未明确，近年来有部分学者就间歇性外斜视患者眼外肌的组织学进行研究，发现眼外肌的超微结构出现了不同程度的异常［7-8］。内直肌虽属于眼外肌的组成部分，但尚未见关于间歇性外斜视患者内直肌的组织学研究。

内直肌等眼外肌是比较特殊的横纹肌，形态功能等特性不同于人体其他骨骼肌，内直肌通常需高速收缩并持续处于活动状态，还须调节收缩力的程度，以精确协调双眼的运动状态，保证视力清晰，因此具有较强的收缩性和抗疲劳性［9］。肌球蛋白是各类肌细胞中含量最多的结构蛋白和收缩蛋白，是构成肌肉肌原纤维粗肌丝的基本组成蛋白，是横纹肌细胞中表达最丰富的蛋白［10］。肌动蛋白结构及功能相对简单，分子单体上有与肌球蛋白头相结合的位点。MYH13 是人类17 号染色体快速/发育MYH 基因簇的重要成员之一，也是祖先骨骼肌与心肌肌球蛋白分化后在快速/发育簇中出现的第1 个特异性肌球蛋白，具有物种间高度保守性，对眼外肌收缩特性有重要调控作用［11］。MYH 13 异构体在眼外肌中表达较丰富，在眼球运动中有较重要的作用。有研究发现［12］，斜视眼外肌中一些基因表达变化与肌纤维形态、数量等相关，MYH13 在眼外肌中表达，在眼外肌高速扫视收缩中发挥重要作用。何一旻等［13］的研究发现，MYH13 在小鼠眼外肌中同样特异性高表达，且敲除MYH13 后可导致小鼠眼外肌的超微结构异常。本研究采用免疫组化染色和Western blot 法观察肌球蛋白、肌动蛋白、MYH 13、MYH 1 在不同年龄间歇性外斜视患者内直肌中的表达，结果提示低龄间歇性外斜视患者内直肌中MYH 13、肌球蛋白、肌动蛋白表达水平相对较高，与姚静艳等［10］的研究结果部分相符。杨英等［14］发现，共同性外斜视患者眼外肌MYH13mRNA 与蛋白水平均低表达，MYH13 高表达患者内直肌肌纤维平均横截面积较大、肌纤维含量较高，有利于术后斜视度数矫正和双眼视觉功能恢复。本研究Spearman 性相关分析结果显示，MYH 13、肌球蛋白、肌动蛋白表达水平与年龄呈负相关。因此建议低龄患者尽早进行矫正手术。刘育榕等［15］指出，小于9 岁的间歇性外斜视患者进行于斜视矫正术后双眼视功能改善情况更优，复发率更低。

综上，低龄间歇性外斜视患者内直肌中肌球蛋白重链表达水平相对较高，内直肌中肌球蛋白重链表达水平与年龄呈负相关。

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