Hmcn1对MC3T3-E1细胞体外成骨分化、迁移及增殖影响的实验研究

周 涛， 王佐林

（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔种植科，上海 200072）

Hemicentin1（Hmcn1）基因编码的同名蛋白是Hemicentin蛋白家族中的一员。Hemicentin家族所编码的是免疫球蛋白超家族的一种细胞外基质蛋白，在几乎所有的后生动物中都具有同源结构[1]。Hmcn1在组织所需的细胞间的短暂接触中发挥重要作用，对于细胞的组织、迁移、基底膜的侵袭及在细胞和细胞间形成稳定的接触方面，其具有重要意义[2]。研究[3]发现，Hmcn1可以引导成纤维细胞的分化，并在分化过程中调节应激纤维的形成，并且可以诱导转化生长因子-β（transforming growth factor，TGF-β）介导的效应。且Hmcn1可以介导TGF-β诱导足细胞细胞骨架的重排[4]。由于TGF-β在成骨细胞增殖分化及成骨调控中发挥了重要作用[5-8]，且又有研究[9]发现Hmcn1基因在附着于脱矿骨表面的成骨细胞中表达上调，所以Hmcn1是否对成骨细胞的生理活动发挥作用则成为疑问。

目前并无文献报道Hmcn1对成骨细胞增殖、迁移及成骨功能影响的相关研究。本实验旨在通过体外培养MC3T3-E1小鼠前成骨细胞系，观察Hmcn1在成骨诱导后的表达变化，再通过小干扰RNA（siRNA)敲降技术观察敲降Hmcn1对MC3T3-E1细胞成骨分化、迁移及增殖能力的影响，并探究Hmcn1对MC3T3-E1细胞功能影响可能的机制。

1.1 主要材料、试剂和仪器

MC3T3-E1细胞（武汉普诺赛公司，中国），α-MEM 培养液（Gibico公司，美国），Opti-MEM减血清培养液（Gibico公司，美国），青链霉素双抗（Hyclone公司，美国），血清（BI公司，以色列），胰蛋白酶（Gibico公司，美国），TRIzol 试剂（TaKaRa公司， 日本），结晶紫染色剂（上海碧云天公司，中国），成骨诱导液（赛业公司，中国），siRNA质粒（北京擎科公司，中国），PCR引物（北京擎科公司，中国），实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒（TaKaRa公司，日本），细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（同仁公司，日本），碱性磷酸酶（ALP）显色试剂盒（上海碧云天公司，中国），CO2培养箱（Thermo公司，美国），微量移液器（Thermo公司，美国），冷冻高速离心机（Dragonlab公司，中国），超微量紫外-可见光分光光度计（Thermo公司，美国），荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士），荧光显微镜（蔡司公司，德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 MC3T3-E1细胞的成骨诱导培养及通过RT-qPCR观察Hmcn1的表达量 将MC3T3-E1细胞体外培养至细胞汇合度达90%左右时，换用成品成骨诱导液诱导培养。分别在诱导培养的第0、3、7、14天时收集细胞样品，提取RNA，用RT-qPCR检测Hmcn1表达水平的变化。

1.2.2 使用siRNA敲降MC3T3-E1细胞 采用设计合成的siRNA转染MC3T3-E1细胞，敲降Hmcn1，作为实验组（敲降组），并同时构建空转的对照组。以2×105个/cm2的密度将MC3T3-E1细胞接种于12孔板中，待12孔板内的细胞汇合度达80%左右时开始转染。准备2只1.5 mL的埃彭道夫管（Eppendorf pipette，EP），分别称为A管和B管，A管加入150 μL Opti-MEM减血清培养液和9 μL 20 μmol/L的siRNA存储液，B管加入 150 μL Opti-MEM减血清培养液和9 μL Lipo3000转染试剂。然后混匀A管和B管，室温孵育10 min，形成siRNA/Lipo3000混合液，将以上混合液加入含有细胞的12孔板中，每孔加入100 mL混合液，缓慢匀速滴加。细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h后通过RT-qPCR法检测其敲降效率。

1.2.3 检测敲降后成骨标志物表达量的变化 将MC3T3-E1细胞接种于12孔板中，按照1.2.2实验步骤中的转染步骤转染MC3T3-E1细胞，转染后每隔3天用成骨诱导液换液，并每隔3天在换液的同时进行1次siRNA的追加转染。分别取转染且成骨诱导后0、3、7、14 d的细胞样本，提取总RNA，通过RT-qPCR检测Hmcn1、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、成骨细胞特异性转录因子（OSX）、骨钙素（OCN）、Runt相关转录因子 2（Runx2）、ALP 表达量的变化。

1.2.4 CCK-8实验检测 将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞用胰蛋白酶消化，制作成细胞悬液，将其接种至96孔板中，每孔控制细胞数为1 000个左右，每组设4个复孔。于37 ℃、5%CO2条件下孵育培养5 d。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，轻轻敲击培养板使其混匀，37 ℃下孵育2 h，分别测量450 nm处每孔的光密度（optical density，OD）值。根据OD值绘制增殖曲线。

1.2.5 ALP染色 MC3T3-E1细胞成骨诱导培养后，于第7天将其取出孔板，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3次，用ALP孵育液孵育2～6 h，再次用PBS漂洗，风干后观察染色状况。

1.2.6 茜素红S（ARS）染色 MC3T3-E1细胞成骨诱导培养后，于第21天将其取出孔板，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，用PBS漂洗3次，每孔加入ARS孵育液孵育24 h，观察染色状况。

1.2.7 划痕实验 在12孔板背面用记号笔和直尺画均匀横线，大约每隔0.5 cm画一道，横穿过孔，每孔至少穿过2条线。在孔中接种MC3T3-E1细胞，待细胞完全长满孔板后，用200 mL枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕。划痕后用PBS洗细胞，换液，继续放入37 ℃培养箱培养，在培养后的0、24、48 h 时取样，拍照。

1.2.8 Transwell迁移实验 在6孔或12孔板内培养细胞，待细胞长满孔板后，用胰蛋白酶消化细胞，离心后用无血清培养液重悬，调整细胞密度至5×105个/mL。取细胞悬液100 μL加入Transwell小室。于Transwell孔板下室加入600 μL含20%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培养液。常规培养24 h后取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗2遍，用甲醇溶液固定30 min后风干Transwell小室。用0.1%结晶紫试剂染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移的细胞，用PBS洗3遍。显微镜下随机选5个视野观察细胞，并计数。计数完成后，用3%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，取洗脱液，用酶标仪测OD值（570 nm），以间接反映细胞数目。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 Hmcn1在MC3T3-E1细胞成骨诱导后出现表达上调

在对 MC3T3-E1细胞进行成骨诱导 0、3、7、14 d时分别收集细胞样品，并进行检测，观察到Hmcn1基因的表达水平在成骨诱导后持续上调，到第7天时达到最高，至第14天时略有回落（P＜0.05，图1）。

图1 RT-qPCR检测成骨诱导后Hmcn1表达的变化Figure 1 RT-qPCR analysis of Hmcn1 expression after osteogenic stimulation

2.2 siRNA敲降Hmcn1效率的检测

分别提取siRNA转染48 h的实验组和空转的对照组RNA，通过RT-qPCR检测敲降效率，多次实验确定其敲降效率为75%左右（P＜0.01，图2A）。

2.3 Hmcn1敲降后，成骨标志物表达量的变化

用siRNA敲降成骨诱导培养的MC3T3-E1细胞，分别在成骨诱导第 0、3、7、14 天时提取细胞 RNA。通过RT-qPCR检测到成骨诱导3 d时，敲降效率为 75%， ALP、BMP-2、OSX 的表达量下调（P＜0.05，图2B）；
成骨诱导7 d时，敲降效率为81%，观察到BMP表达下调明显（P＜0.01，图2C）；
成骨诱导14 d时，敲降效率为75%，观察到OSX、BMP-2、OCN表达下调明显（P＜0.05，图 2D）。

图2 siRNA敲降效率及敲降后成骨标志物表达量的变化Figure 2 siRNA knockdowm efficiency and the expression of osteogenic markers changes after knockdown

2.4 敲降Hmcn1对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响

2.4.1 CCK8实验结果 CCK8实验结果显示，与对照组相比，敲降组增殖能力有所提升，在实验第7天时，2组差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3 siRNA敲降后细胞增殖能力的变化Figure 3 Changes of cell proliferation capacity after siRNA knockdown

2.4.2 划痕实验结果 通过划痕实验观察敲降Hmcn1对MC3T3-E1细胞迁移能力的影响。结果显示，与对照组相比，敲降组迁移能力显著下降（P＜0.05，图 4A、B）。

2.4.3 Transwell实验结果 通过Transwell实验检测敲降Hmcn1对MC3T3-E1细胞迁移能力的影响。结果显示，与对照组相比，敲降组迁移能力显著下降（P＜0.05，图 4C、D）。

图4 siRNA敲降对MC3T3-E1细胞迁移能力的影响Figure 4 Effect of siRNA knockdown on migration of MC3T3-E1 cells

2.5 敲降Hmcn1对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

结果2.3中，敲降Hmcn1后，BMP-2的mRNA表达水平低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。诱导至第7天时， ALP染色结果（图5A）显示，2组细胞着色均符合MC3T3-E1细胞的特性，对比发现，敲降组染色较对照组略浅且着色细胞较对照组少。诱导至第21天时，ARS染色结果（图5B）显示，2组均成功观察到钙结节，说明Hmcn1对MC3T3-E1细胞成骨向分化有一定影响。

图5 siRNA敲降对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响Figure 5 Effect of siRNA knockdown on osteogenesis of MC3T3-E1 cells

Hmcn1是Hemicentin家族中的一员，是编码免疫球蛋白超家族的一种细胞外基质蛋白，该蛋白由von Willebrand A结构域、串联免疫球蛋白模块、多个串联的表皮生长因子和一个蛋白羧基末端模块组成[1]。Hemicentin家族成员在多种细胞-细胞和细胞质连接中发挥重要作用。Hmcn1参与了细胞动态基础的形成，对细胞的组织、迁移、基底膜的侵袭及在细胞和细胞间形成稳定的接触方面，具有重要意义[2]。

研究[3]发现，Hmcn1可以引导成纤维细胞的分化，能在分化过程中调节应激纤维的形成，并且可以诱导TGF-β介导的效应。Hmcn1还可以介导TGF-β诱导足细胞细胞骨架的重排[4]。而据文献[5-8]报道，TGF-β对诱导骨组织再生、促进成骨分化有显著影响。另外，Hmcn1基因在附着于脱矿骨表面的成骨细胞中表达上调，考虑其可能作为成骨细胞附着和迁移的向导，对成骨细胞的功能具有一定意义[9]。

本研究中，首先在体外对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导培养，观察到Hmcn1表达水平在细胞成骨分化过程中出现明显上调。然后，通过siRNA改变Hmcn1在MC3T3-E1细胞中的表达水平，从而观察Hmcn1对MC3T3-E1细胞增殖、迁移及成骨分化能力的影响。我们选取了BMP-2、OSX、OCN、Runx2、ALP这些已经被证实的重要成骨标志物作为检测标志[10]。我们在敲降实验中观察到，在成骨分化的第3、7、14 天时，随着Hmcn1表达量的下调，BMP-2 的表达量持续下调（P＜0.05），而 ALP、OSX、OCN等成骨标志物在不同时间点都有明显的下调（P＜0.05）。Lauzon等[11]研究发现，BMP-2可以通过与PI3K/Akt信号通路的相互作用，促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。Aquino-Martinez等[12]的研究发现，BMP-2可以通过与Smad信号通路的互相作用对成骨进行调控。此外，Yang等[13]研究发现，BMP-2可以通过磷酸化应激活化蛋白激酶，增强成骨细胞分化。赵璇等[14]认为，OCN的血清含量能反映成骨细胞的活性。ALP也是重要的成骨标志物，其浓度水平对成骨细胞活性有重要的提示作用[15]。因此，我们认为Hmcn1很可能主要是通过BMP-2信号通路对MC3T3-E1细胞的多种功能进行调控的。在ALP染色中，Hmcn1敲降组的染色比对照组着色细胞少。在ARS染色实验中，2组均成功观察到钙结节，此时2组染色无明显差异。根据染色结果，考虑为Hmcn1对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。在随后的CCK8实验中，我们观察到Hmcn1敲降组的细胞增殖能力有提升，这也与敲降后细胞成骨分化能力下降互为印证。接下来，我们在细胞划痕实验和Transwell实验中观察到Hmcn1敲降后，细胞迁移能力显著下降。

综上所述，本研究探讨了Hmcn1基因对MC3T3-E1细胞体外成骨分化、迁移及增殖的影响，初步证实了Hmcn1基因正向调控MC3T3-E1细胞的迁移能力，并对MC3T3-E1细胞成骨分化能力有一定影响。本研究为Hmcn1基因对成骨的影响提供了新的见解，而其具体机制仍有待进一步挖掘。

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