广西三江茶树种质资源遗传多样性分析

蒙容君，陈亮，许原，林纬，周歧伟，谢义林，赖定清，赖家业

广西三江茶树种质资源遗传多样性分析

蒙容君1，陈亮2，许原1，林纬3，周歧伟3，谢义林3，赖定清4*，赖家业3*

1 广西大学林学院，广西 南宁 530004；
2. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；

3. 广西大学农牧产业发展研究院，广西 南宁 530004；
4. 三江县多耶楼茶业有限公司，广西 三江 545500

为明确广西三江茶树种质资源遗传多样性，采用简单重复序列间扩增（ISSR）和相关序列扩增多态性（SRAP）2种标记技术，对三江地区72份地方茶树种质资源与5个引进品种进行遗传多样性分析，两种标记结果都显示出高水平的遗传多样性（H=0.30，I=0.44），群体间显示出高的遗传分化（Gst=0.056）和基因流（Nm=8.64）。群体内观察到的遗传变异远高于群体间的遗传变异。聚类分析结果显示，大部分三江茶树种质资源聚为一类，与引进品种划分成两个亚群，聚类分析结果与主坐标分析（PCoA）的结果一致。本研究为三江茶树种质资源的保护和利用提供了分子水平的证据。

茶树；
分子标记；
遗传多样性；
种群结构

茶叶作为最受世人喜爱的三大无酒精饮料之一，多由山茶科（Theaceae）山茶属（）茶树[(L.) O. Kuntze]的嫩芽叶制作而成。广西柳州三江县位于黔桂湘三省交界处，地处茶树起源中心的辐射范围内，茶树栽培历史悠久，拥有丰富的茶树种质资源[1]。近年来，由于一些野生茶具有品质优良、风味独特且成本低等特点，导致古茶树资源被过度开采，部分茶树资源因此消失，严重阻碍了茶树种质资源保存和良种选育事业进程和发展。因此开展茶树种质资源遗传多样性研究，对三江县茶树种质资源的保护和利用、专用新品种选育以及茶产业健康发展等具有重要意义。

DNA分子标记技术是检测种质资源多样性的有效工具[2-3]，在植物分子标记技术中简单重复序列间扩增（ISSR）和相关序列扩增多态性（SRAP）是使用广泛的两种标记，具有诸多优点。ISSR分子标记以加锚简单重复序列（SSR）寡聚核苷酸作引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行PCR扩增，非扩增SSR本身，因其试验重复性强，可解释更高程度的DNA多态性等优点，在水稻[4]、玉米[5]、甘蔗[6]等作物的遗传育种中被广泛使用。刘青等[7]利用ISSR分子标记技术对贵州省145个古茶树个体进行遗传多样性分析，对古茶树资源的保护具有重要指导作用。孙雪梅等[8]利用ISSR对云南67份茶树种质资源进行了遗传多样性分析，揭示了供试样品之间的亲缘关系，为云南省扩宽地方茶树种质的遗传基础及野生茶树遗传潜力评估提供了理论依据。SRAP分子标记技术通过双引物设计对基因的特定区域进行扩增，正向引物对外显子区域进行特异扩增，反向引物对内含子区域或启动子区域进行特异扩增[9]，该标记具有稳定、产率高、便于扩增目标片段等特点[10]。林萍等[11]利用SRAP分子标记技术对同属山茶属的12个无性系油茶品种进行遗传差异比对，为长林系列的无性系油茶种源的开发和利用构建理论基础。Zhang等[12]利用EST-SSR、SCoT和SRAP 3种标记对秦巴山区50份茶树种质资源进行遗传多样性以及群体结构评估，揭示了外来茶树品种的引进对秦巴山区茶叶基因库产生的影响。在DNA分子标记分析遗传多样性研究中，综合运用多种分子标记，能最大程度优化聚类分析[13]。本研究利用12个ISSR引物和16对SRAP引物组合，对72份三江茶树种质资源及5份外省引进的栽培品种进行遗传多样性、遗传结构与分化以及聚类与遗传距离分析比较，以期明确广西三江地方茶树种质资源遗传多样性现状，旨在为三江茶专用新品种选育提供理论基础。

1.1 试验材料

2010年采集广西柳州三江侗族自治县域内形态上具有代表性的自然生长茶树枝梢，采用扦插繁育后种植于三江县多耶楼茶业有限公司本地茶树种质资源圃，在经过对总体样本进行形态学分析的基础上，选出具有代表性的三江地方茶树种质资源72份（编号为1～72），同时以5个（CK1～CK5）外省引进的茶树优良品种作为对照，基本信息见表1。每份茶树品种资源采集10～15片中部无害虫的嫩叶，使用变色硅胶干燥，在–20 ℃下保存。

1.2 茶树基因组DNA的提取与检测

取经过干燥处理的茶树嫩叶，采用植物基因组DNA快速抽提试剂盒CW0531S（江苏康为世纪生物科技股份有限公司）提取样本DNA。使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳法检测DNA完整性，采用超微量分光光度计（NanoDrop 1000）对DNA浓度和纯度进行评估。合格DNA样品用超纯水稀释至20 mg·L-1，置于冰箱−20 ℃保存备用。

1.3 引物的筛选

本研究使用的ISSR引物来源于哥伦比亚大学公布的第9套100个ISSR通用引物序列[14]；
SRAP引物参考文献[15-16]设计的234对SRAP引物组合，共包含13条上游引物（Me1～Me13）和18条下游引物（Em1～Em18）。引物的筛选分为初筛和复筛2个步骤，选取11个表型性状差异较明显的资源与5个参照品种作为初筛样本，选出扩增产物主带明显、条带清晰的引物；
使用所有样本进行复筛，选择多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物作为最终引物；
最后以每条引物Tm值为基础温度，设置12个温度梯度，根据扩增条带的电泳结果确定每个引物的最适退火温度。

表1 茶树种源信息

1.4 PCR扩增

ISSR-PCR扩增体系（25 μL）：1 μL DNA模板、1 μL引物（20 mg·L-1，上下游引物各0.5 μL）、12.5 μL Powerpol 2X PCR Mix、10.5 μLddH2O。ISSR-PCR扩增程序：98 ℃预变性45 s；
98 ℃变性10 s，退火（每个引物退火温度见表2）30 s，72 ℃延伸100 s，共30个循环；
72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

SRAP-PCR扩增体系（25 μL）：1 μL DNA模板、1 μL引物（20 mg·L-1，上下游引物各0.5 μL）、12.5 μL Powerpol 2X PCR Mix、10.5 μL ddH2O。SRAP-PCR扩增程序：98 ℃预变性45 s；
98 ℃变性10 s，退火（每个引物退火温度见表2）30 s，72 ℃延伸100 s，共32个循环；
72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR扩增产物在含有Gelred核酸染料的1%琼脂糖凝胶0.5×TAE缓冲液中，130 V电泳40 min后，通过超灵敏多功能凝胶成像仪（Amersham Imager 600）拍照保存。

1.5 数据统计及分析

人工读取电泳结果数据，并进行统计处理。将条带中清晰可见以及可重复的标记为“1”，同一位置上条带缺失或者弱带标记为“0”，形成“0、1”数据矩阵，分别得到ISSR、SRAP及综合两者（ISSR+SRAP）的数据。

1.5.1 遗传多样性分析

利用Excel统计每个引物或每对引物组合扩增的条带以及多态性条带数，计算多态位点百分率（PPB），利用POPGENE 1.32计算遗传参数，如观察到的等位基因数量（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei"s基因多样性指数（H）、Shannon信息指数（I）。

1.5.2 遗传结构与分化分析

利用Structure软件[17]，对群体进行K为2～6的贝叶斯聚类，估算最佳群体组群数K和个体Q矩阵，利用Structure Harvester[18]计算lnP(K)和数据对数概率变化率（ΔK），利用Popgene 1.32软件计算群体内多样性（Hs）、总基因多样性和基因流（Nm）。

1.5.3 聚类分析

利用Popgene 1.32软件得到聚类分析图，然后使用MEGA 7.0和Adobe Illustrator 2021构建聚类分析图。利用GenAlEx 6.2加载宏软件进行主坐标分析（PCoA）。

2.1 引物筛选结果与多态性分析

ISSR引物经过筛选，共获得12个条带清晰、多态性高且重复性好的引物，引物基本信息见表2。12个引物共扩增出124个条带，多态性条带有122条，PPB为98.39%。12个引物平均扩增条带数为10.33条，平均多态性条带数为10.17条，PPB最低的引物是UBC844，为84.62%，其余引物PPB均为100%，所有引物均表现出极高的多态性。扩增位点数最多的引物是UBC844，扩增出了13个条带；
其次是引物UBC835、UBC841和UBC845，均扩增出12个条带；
扩增条带最少的引物是UBC873，只扩增出8条。以引物UBC835为例，其对72个样本和5个对照的ISSR-PCR的电泳结果如图1所示。

SRAP引物组合经过筛选，共获得16个条带清晰、多态性高且重复性好的引物组合，引物组合基本信息见表3。16个SRAP引物组合共扩增出196个条带，多态性条带有193条，PPB为98.47%。16条引物组合平均扩增条带数为12.25条，平均多态性条带数为12.06条，PPB最低的引物组合是Me7/Em6和Me10/Em3，为92.86%，所有引物均表现出极高的多态性。扩增位点数最多的引物组合是Me5/Em8，扩出了17条条带；
其次是引物组合Me2/Em15，扩增出16条条带；
扩增条带最少的引物组合是Me1/Em15，只扩增出6条。以引物组合Me10/Em3为例，其对72个样本和和5个对照的SRAP-PCR的电泳结果如图2所示。

综合ISSR和SRAP分析结果可知，两个标记共扩增出320个条带，多态性条带有315条，PPB为98.44%，平均扩增条带数为11.43条，平均多态性条带数为11.25条。

表2 ISSR引物信息及扩增结果

注：M为Marker，1～72代表72份三江县茶树种质资源，73～77代表CK1～CK5

2.2 遗传多样性分析

将所选的72份三江地方茶树种质资源使用Popgene 1.32软件计算等位基因数量（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei"s基因多样性指数（H）、Shannon信息指数（I）等相关系数，结果如表4所示。

ISSR引物检测到的平均Na为1.99，Ne为1.47，H为0.29，I为0.44；
SRAP引物组合检测到的平均Na为1.99，Ne为1.49，H为0.30，I为0.46，两种标记的结果趋于一致。72份三江地方茶树种质资源的平均Na为1.99，Ne为1.48，H为0.30，I为0.45。

2.3 遗传分化与遗传结构分析

将参试的77份茶树种质资源按照种源地划为3个群体（广西、浙江和福建），计算群体内多样性（Hs）、总基因多样性（Ht）和基因流（Nm）等遗传参数。结果表明（表4），ISSR引物检测的Ht和Hs分别为0.30和0.28；
SRAP引物检测的Ht和Hs分别为0.31和0.29，两种标记所得到的结果趋于一致。

表3 SRAP引物信息及扩增结果

注：M为Marker，1～72代表72份三江县茶树种质资源，73～77代表CK1～CK5

结合ISSR标记和SRAP标记结果，77份茶树种质资源的Ht为0.31，Hs为0.29；
种群间分化系数（Gst）为0.056，则相应的种群内的Gst为0.944，基因流系数为8.64。通过ISSR和SRAP标记结果，单独对2个对照群体（浙江群体与福建群体）进行遗传结构分析，种群间Gst为0.251，Nm为1.49。

72份三江地方茶树种质资源与5个引进品种的遗传结构存在差异（图3）。基于ΔK推测最佳亚群体数，K的最大值出现在K＝4，ΔK=37.65。当假设供试茶树种质资源存在4个亚群体（K=4）时，根据Q矩阵排列结果，GY02与5个引进品种聚为1个亚群，其余茶树种质资源则分为另外3个亚群。

2.4 聚类与遗传距离分析

分别利用ISSR标记、SRAP标记、以及ISSR+SRAP标记的基因型数据对77份茶树种质资源进行非加权组平均法（UPGMA）聚类。基于ISSR标记的UPGMA树状图显示（图4），样本间遗传相似系数为0.726～0.960，变幅为0.234。在遗传相似系数为0.750时，可将全部样本划分为4个亚群。第1亚群包括除了GY02和LK12之外的70份三江茶树种质资源，第2亚群为LK12，第3亚群为GY02，第4亚群为5个引进品种。样本间的遗传距离为0.041 2 ～0.777 2，其中LK12和黄金芽的遗传距离最远，遗传距离最近的是GJ02和GJ03。

基于SRAP标记的UPGMA树状图显示（图5），样本间遗传相似系数为0.515～0.882，变幅为0.367。其中，在遗传相似系数为0.535时，可将全部样本划分为3个亚群。第1亚群包括除GY02之外的71份三江茶树种质资源；
第2亚群包含GY02、嘉茗1号、福云6号、福鼎大毫茶和梅占；
第3亚群为黄金芽。样本间的遗传距离为0.125～0.663，其中LK06和福鼎大毫茶的遗传距离最远，遗传距离最近的是GJ02和GJ03。

基于ISSR+SRAP标记的UPGMA树状图显示（图6），样本间遗传相似系数为0.534～0.913，变幅为0.379。其中，在遗传相似系数为0.572时，可将全部样本分为3簇。第1簇包括71个三江茶树种质资源，第2簇为GY02，第3簇为5个引进茶树品种。样本间的遗传距离为0.091 6～0.626 7，其中遗传距离最远的为LK06和福云6号，遗传距离最近的是GJ02和GJ03。

使用Genalex加载宏将两种标记结果进行PCoA分析（图7），两个PCoA轴可以分别解释12.65%和8.28%的遗传变异。将主坐标分析图分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个区域。三江茶树种质资源主要分布在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ区，小部分分布于Ⅱ区且大部分散点较为集中，而5个参照品种均分布于Ⅳ区，且与三江的种质资源距离较远。双标记的PCoA结果与UPGMA聚类结果基本一致。

表4 遗传多样性与遗传分化系数

注：1～72代表72份三江县茶树种质资源，73～77代表CK1～CK5

图4 ISSR标记77份茶树种质资源的UPGMA聚类图

图5 SRAP标记77份茶树种质资源的UPGMA聚类图

图6 ISSR+SRAP标记77份茶树种质资源的UPGMA聚类图

对茶树种质资源进行遗传多样性评估，可以全面有效反映茶树群体的品种现状，也是品种选育和种质创新的基础。本研究中使用12个ISSR引物和16个SRAP引物组合标记对72个三江茶树种质资源进行遗传多样性分析，共检测到320个等位基因条带，其中多态性条带315个，PPB平均值达到了98.44%，ISSR与SRAP标记的Na平均值均为1.99。刘彤等[19]利用ISSR分子标记分析了柳州九万山93份茶树种质资源，结果显示，112个等位基因条带平均多态比例为93.8%；
郑丹琳等[20]利用ISSR分子标记对柳州汪洞乡87份种质资源进行分析，10条引物共扩增出67条谱带，多态比例达95.5%。前人的研究和本研究的结果相似，标记的引物均显示极高的多态性比例，说明柳北区域融水——三江地区茶树种质资源在分子水平上遗传多样性水平高。同时也验证了本研究中筛选出的ISSR引物和SRAP引物组合对试验材料的遗传多样性检测效率高，可有效揭示茶树群体的遗传多样性。从扩增位点数来看，SRAP的检测效率略高于ISSR的检测效率。

双标记结果分析显示，Nei"s基因多样性指数（H）和香农信息指数（I）的平均值分别为0.30和0.45；
与宁静等[21]基于ISSR分子标记对湖南黄金茶群体遗传多样性分析结果（H=0.30，I=0.45）相似，略低于李丹等[22]基于ISSR分子标记对江华苦茶群体进行遗传多样性分析结果（H=0.38，I=0.56），但高于陈涛林等[23]基于ISSR分子标记对汝城白毛茶群体的分析结果（H=0.26，I=0.40）。与其他研究对比，三江茶树种群遗传多样性处于较高的水平。

综合本研究ISSR和SRAP数据，3个茶树种群间的变异为5.6%，而种群内的变异系数为94.4%，Nm指基因在群体间或群体内的运动[24]，普遍认为，当Nm＜1时，造成遗传分化的主要原因是遗传漂变；
当Nm＞1，基因流阻碍了基因漂变，进而出现遗传分化[25]。本研究中，双标记的Nm为8.64，群体间的Nm系数均大于1，说明本研究所标记的种群间遗传分化远高于种群内遗传分化，与Yao等[26]对全国450份茶树核心种质资源遗传结构和分化研究结果相似。茶树进化过程中，由于自然或人工选择、随机漂变等原因，茶树群体会出现遗传分化[27]，并且茶树雌雄同株、风媒异花授粉的植物学特性[28]，使得所选的种群遗传变异的大多数来自种群内部。各群体之间的生境异质性较大，环境效应增强了三江茶树群体与对照茶树种质群体间的遗传分化水平，而在三江茶树种群内近交，使等位基因均质化，频繁的基因交流也阻止了遗传分化的发生。本研究所有样品均采自三江地区，但引进品种在该地栽培年限较短，基因有效交流频率在自然条件下较低，出现本地种源与外来品种在基因水平上分化较为明显的结果。

聚类分析结果表明，当77份茶树种质资源分为两个亚群时，第一个亚群为除GY02之外的所有三江茶树资源，而GY02与5个参照茶树种则聚为另一个亚群。在Structure遗传结构分析图中，假设所选的种质资源分为4个亚群，GY02与5个参照品种聚为一类。说明GY02与三江地方茶树种质资源在分子水平上差异较为明显。根据初步形态学标记的结果显示，三江茶树群体的芽头茸毛总体呈现出无茸毛或少茸毛特点，而GY02芽头茸毛密，春季的生长势强，在茶树群体种中有较高辨识度，多项形态学指标与三江群体种存在特异性。3个聚类结果均显示，GJ02和GJ03的遗传一致性最高，且遗传距离系数最小，说明GJ02和GJ03亲缘关系较为接近。

ISSR聚类结果中，三江种质资源的亚群里，LK12在更高系数的遗传相似性比较中被划分成单独一组，而在SRAP聚类结果中，除GY02以外的所有三江茶树种质资源聚为一个亚群。推测针对基因组不同片段的不同标记，单个标记不能完全反映群体之间的关系。由于ISSR和SRAP标记都是显性标记，因此本研究将两个标记结合起来进行分析，避免单个标记的限制。两种分子标记的遗传距离结果都显示三江地方茶树种质资源与外省引进品种具有明显的分化。

三江的茶树种群经过长期的自然选择和遗传进化，出现一批适应当地地理气候的茶树品种，说明三江茶树种质资源丰富，具有良好的开发前景。目前已经从中选育了多耶楼1号和多耶楼2号两个茶树新品种，2022年获得了农业农村部植物新品种权授权；
另外还有3个品种已经通过了植物新品种特异性、一致性和稳定性（Distinctness，uniformity，stability，DUS）现场考察。本研究中的72份茶树种质资源的遗传多样性较为丰富，结合聚类和农艺、品质性状分析结果，选用综合性状优异且有一定遗传差异的材料作为育种亲本，对三江茶树种质遗传改良和拓宽遗传多样性具有一定的现实意义。

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Genetic Diversity Analysis of Tea Genetic Resources in Sanjiang, Guangxi

MENG Rongjun1, CHEN Liang2, XU Yuan1, LIN Wei3, ZHOU Qiwei3, XIE Yilin3, LAI Dingqing4*, LAI Jiaye3*

1. College of Forestry, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2.Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3. Institute of Agriculture and Animal Husbandry Development, Guangxi University, Nanning 530004, China; 4. Sanjiang County Duoyelou Tea Industry Co., Ltd., Sanjiang 545500, China

In order to clarify the genetic diversity of tea genetic resources in Sanjiang, Guangxi, two marker techniques, simple inter-repeat sequence amplification (ISSR) and correlated sequence amplification polymorphism (SRAP) were used to analyze the genetic diversity of 72 local tea genetic resources and five introduced cultivars in Sanjiang region. The results of both marker techniques show high levels of genetic diversity (H=0.30, I=0.44), high genetic differentiation between populations (Gst=0.056) and gene flow (Nm=8.64). The genetic variation observed within populations was much higher than that between populations. The cluster analysis shows that most of the tea genetic resources in Sanjiang were clustered into one group and the introduced cultivars were clustered into the other, which was consistent with the results of PCoA. This study provided evidence at the molecular level for the protection and utilization of tea germplasmin Sanjiang.

, molecular marker, genetic diversity, population structure

S571.1

A

1000-369X(2023)02-147-12

2022-12-15

2023-01-19

三江县本地茶树产业科技创新示范基地建设项目（桂科AD19245192）

蒙容君，男，硕士研究生，主要从事林木（包括茶树）遗传育种研究。*通信作者：752102015@qq.com；
laijiayie@126.com

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