宿主靶向抗乙型肝炎病毒治疗策略研究新进展*

方慧晶 综述,朱传龙,章莉莉 审校

HBV感染已呈世界性流行。据统计,全球每年约有88.7万人死于HBV感染相关疾病,其中肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)分别占死亡原因的52%和38%。目前,HBV的治疗很少能完全清除病毒,即使药物应答良好的患者在停药后仍可能会出现病毒学复发。HBV难以清除的关键,一方面在于病毒的复制与转录模板——共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的持续存在,另一方面在于宿主免疫反应的缺陷。现有的抗病毒药物治疗局限于抑制病毒的复制,从而延缓肝脏纤维化及肝细胞肝癌的发生,然而对cccDNA的持续存在无能为力[1]。已有研究发现,HBV cccDNA的形成依赖于宿主因子[2],HBV生命周期的完整性与宿主因素密不可分,靶向宿主的治疗药物有极大的治疗潜力。由于乙型肝炎病毒株的变异,针对宿主自身因素的治疗发生耐药的风险远远低于针对病毒本身的药物,同时其作用的靶点较仅针对病毒的药物也更为广阔。此外,有研究证明,新型药物的研发及联合使用,会增加 HBsAg 血清清除率,诱导 HBV的功能性治愈,但具体疗效仍需要大量临床研究验证[3]。目前,抑制病毒进入、破坏病毒核酸稳定性以及增强宿主对HBV的免疫反应是抗病毒药物研发的主要思路。

HBV具有高度的物种特异性和嗜肝性,需要通过肝脏特异性高亲和力受体——钠离子牛黄胆酸共转运蛋白(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)介导进入肝细胞[4]。目前已证实HBV首先在HBsAg的S域中抗原环的介导下,以低亲和力的方式附着在肝细胞膜的硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)上。紧随其后,L-HBsAg的PreS1域以高亲和力的方式与肝细胞基底膜上的NTCP结合,此时PreS1 N端肉豆蔻化以增强受体识别能力从而促进病毒感染[5]。因此,靶向NTCP及其底物介导的病毒入胞过程为探索抗HBV治疗提供了更广阔的思路[6]。Myrcludex B(别名Bulevirtide)是一种源自HBV preS1结构域的合成脂肽,可与HBV竞争性结合NTCP,从而特异性阻断病毒对正常肝细胞的感染,同时抑制已感染肝细胞内cccDNA的生成。一项IIb期临床试验表明,Myrcludex B +PegIFN-α治疗48周后,HBV/HDV合并感染患者血清HBsAg阴转率为27%[7]。此外,替诺福韦与Myrcludex B联合用药表现出良好的安全性和耐受性,且两种药物对彼此药代动力学稳态无影响[8]。目前Myrcludex B正进入III期临床研究,研究者将对CHB患者进行单药治疗或与PegIFN-α联合治疗的效果评估。另一种进入抑制剂环孢菌素A(CsA)及其衍生物则是通过抑制preS1附着于NTCP而阻止病毒进入肝细胞,CsA衍生物SCY450和SCY995仅抑制 HBV 进入而不显著影响 NTCP 的转运蛋白功能,避免发生胆汁酸摄取障碍[9]。曲格列酮从特异性抑制表皮生长因子诱导的NTCP寡聚化方面阻断HBV preS1及其受体NTCP的内化,抑制HBV感染[10]。有研究表明E-钙粘蛋白通过与糖基化的NTCP相互作用促进其在肝细胞中的膜定位,而敲低E-钙粘蛋白可显著降低HBV颗粒的感染以及HBV假颗粒进入受感染的肝细胞和细胞系[11]。NTCP的糖基化在生物学上直接和/或间接影响HBV感染过程[12]。靶向NTCP的药物可阻止病毒进入未感染肝细胞,从而对肝脏形成一定的保护作用,但是其终究对已进入细胞并开始转录复制的病毒束手无策,因此上述药物势必要联合其他抗病毒药物治疗,达到最终的临床治愈。

2.1 靶向宿主RNA相关因子 已知HBV mRNA代谢依赖于宿主转录机制,影响宿主细胞mRNA代谢周期的RNA监测和降解机制很可能同时影响HBs mRNA产生与降解。据报道,HBV mRNA的稳定性,由宿主非经典的多聚腺苷酸化聚合酶相关结构域5和7(noncanonical poly(A) polymerase-associated domain 5 and 7,PAPD5 and PAPD7)调节,在敲低PAPD5 / 7后可观察到HepaRG细胞和原代人肝细胞中HBs显著降低[13]。宿主蛋白PAPD5/7的主要功能是将异常的非编码RNA(ncRNA)的3"末端寡聚腺苷酸化,进行外泌体降解。而HBV通过劫持PAPD5 / 7的RNA腺苷酸化功能来稳定病毒mRNA[14]。作为靶向宿主途径调节PAPD5/7和HBV mRNA间相互作用的药物,口服小分子二氢喹啉酮(DHQ)可通过抑制宿主PAPD5/7,诱导HBV RNA快速和选择性降解,从而减少病毒基因转录产物[15]。具有DHQ结构的先导化合物RG7834已被证明可在体外和体内选择性地减少HBsAg、HBeAg以及HBV DNA[16]。而对于已报道的RG7834急性神经毒性,有研究尝试通过合成高度肝脏特异性DHQ衍生物,以限制药物在血液中的分布,避免药物的全身分布从而减轻甚至消除其对多脏器的毒性作用[17]。另一二氢喹酮类化合物AB-452也表现出HBV特异性抗病毒活性,可抑制HBV DNA复制,降低HBsAg、HBeAg的表达[18]。

2.2 靶向宿主DNA相关因子 作为HBV转录与复制的模板,cccDNA的产生和持续存在是HBV感染最关键的步骤之一,尽管将病毒粒子相关的松弛环状DNA(relaxed circular DNA ,rcDNA)转化为这种稳定的微染色体的过程尚不完全明确,但目前已证实宿主细胞DNA合成和修复因子(如DNA修复酶TDP2或TDP相关蛋白[19],DNA聚合酶α[20],κ[21]、DNA连接酶[22]、FEN1[23]及 DNA拓扑异构酶I和II)是HBV cccDNA合成中不可或缺的因素。病毒库的沉默势必会极大地促进HBV的功能性治愈,因此,从宿主因子方面着手调控cccDNA生成的研究前景深远。其中,TDP2同时作为病毒蛋白解链酶,参与病毒转录和翻译,基于此构建高选择性TDP2抑制剂异恶唑喹啉二酮衍生物[24],为抗HBV治疗开辟了新的思路。宿主细胞DNA修复通路ATR-CHK1抑制剂AZD6738和VE-821可在体外减少cccDNA生成[25]。

除外上述抑制cccDNA产生的宿主因子,目前已被证实对HBV感染有负性调节作用的宿主限制因子包括NF-κB、STAT1和STAT2、PROX1、EZH2、YY1、SIRT1和 SIRT3、 PRMT1、PRMT5、HDAC1、SETDB1、 Smc5/6、ZHX2、DDX3及APOBEC3A和APOBEC3B[26]。研究表明,乙型肝炎病毒编码调节X蛋白(HBx)通过劫持含有细胞DDB1的E3泛素连接酶来靶向降解染色体结构维持复合物5/6(structural maintenance of chromosomes complex 5/6,Smc5/6),促进受感染细胞染色体外病毒基因组的转录[27]。在有效抑制HBx的前提下, Smc5/6复合物可促进人肝嵌合小鼠体内HBV cccDNA沉默,进而实现病毒转录的持续抑制[28]。有研究发现硝唑尼特和pevonedistat (MLN 4924)[29]可阻断Smc5/6的降解并恢复Smc5/6表达,抑制HBV cccDNA转录,其中硝唑尼特已获FDA批准用于治疗多种病毒和寄生虫感染,但仍需要更多临床研究进一步评估抗病毒活性。由此可见,靶向宿主DNA修复机制的思路,极有可能成为最终消除cccDNA的治疗方向。

3.1 靶向固有免疫调节 模式识别受体 (pattern recognition receptor,PRR) 是宿主抗病毒免疫的第一道防线,可检测病毒病原体的保守分子特征并通过PRR家族特异性衔接蛋白(例如,干扰素基因刺激物 (STING) 或 MYD88)以及一组丝氨酸/苏氨酸激酶和转录因子的分层激活启动先天免疫信号传导。慢性乙型肝炎患者肝脏活检的相关研究表明,HBV可逃避病毒携带者的模式识别受体[30],这一特征推进了模式识别受体靶向药物作为潜在抗病毒治疗药物的研究。根据亚细胞定位可以将这些先天免疫传感器分为两大类:位于质膜或内体膜上识别细胞外病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)的PRR,包括 Toll 样受体 (Toll-like receptor,TLR) 和C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLR);存在于哺乳动物细胞的细胞质或细胞核中的PRR,包括NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)、RIG -I 样受体(RIG-I-like receptor,RLR)及其他细胞内 DNA 传感器[31]。

TLR介导通路的激活诱导HBV复制的抑制和HBV特异性适应性免疫的恢复。目前研究较多的TLR7激动剂GS-9620[32],可在浆细胞样树突状细胞中诱导IFN-α产生,在慢性感染 WHV 的土拨鼠和感染 HBV 的黑猩猩中观察到病毒载量显着持续降低[33]。最新研究发现抗SIGLEC-3mAb (10C8)可以逆转 HBV介导的TLR 配体相关的免疫抑制并上调对抗原呈递至关重要的表面分子。此外,10C8 与 GS-9620 具有协同作用,可上调细胞因子的产生以及 MHC-I、MHC-II 和共刺激信号的表达水平[34]。由于在Ib/IIa期试验中,单独使用GS-9620无法达到血清HBV DNA和HBsAg水平的显着变化[35],因此将 GS-9620和10C8 联合使用可增强T细胞免疫力以清除 HBV 感染,是一种很有前景的策略。口服TLR7 激动剂 JNJ-4964通过细胞因子介导的非细胞溶解机制实现抗HBV作用,在临床前实验中观察到剂量依赖性抗HBV活性以及全身细胞因子、B 和 T 细胞诱导激活[36]。TLR8激动剂GS-9688可将土拨鼠肝内WHV DNA和RNA 水平降低 20 倍[37]。GS-9688在人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中诱导细胞因子,通过多种免疫介质激活抗病毒效应功能[38]。研究发现,用GS-9688刺激过的PBMC作为培养基,培养出的HBV感染的原代肝细胞中观察到病毒标志物的减少[39]。而双重TLR 7/8 调节剂2,4-二氨基喹唑啉用于乙型肝炎病毒治疗也正在研究中[40],TLR 2也被证实是HBV感染后B细胞活化所必须的。随着TLR通路中的关键信号转导蛋白——髓系分化初级反应蛋白(myeloid differentiation primary response protein, MyD88)在宿主免疫信号通路中作用的发现,靶向MyD88药物也为抗病毒治疗提供了广泛的思路。但要达到完全清除病毒的目的,还需要更广泛且深入的研究来确定TLR在病毒感染后机体免疫过程中的具体作用通路。

研究表明,HBV利用CLR途径劫持树突状细胞(dendritic cell, DC)亚群从而逃避机体的免疫监视。因此,通过调节病毒聚糖-凝集素轴来改变病毒与宿主间的相互作用,最终触发机体免疫反应达到清除病毒效果不失为抗病毒治疗的另一思路[41]。RIG-I通过识别HBV pgRNA 5" ε 区域并诱导III型干扰素的产生激活机体先天免疫,此外,RIG-I还能以RNA结合的方式,抑制聚合酶介导的衣壳化,达到抗病毒的效果[42]。目前已有RIG-I相关药物进行动物试验,据报道RIG-I/NOD2激动剂SB 9200 (Iranigivir)可降低土拨鼠的血清WHV DNA 及WHsAg和水平[43]。

3.2 靶向特异性免疫 慢性乙型肝炎患者特异性免疫治疗策略最大的挑战是T细胞免疫耐受及病毒特异性T细胞耗竭。有研究表明,在CHB 患者中程序性死亡受体1 (PD-1) 等抑制性受体在T细胞上过度表达,引起T细胞负性调节,这可能是慢性乙型肝炎患者肝脏中T细胞耗竭出现病毒持续性感染难以清除的原因。在Ib 期临床研究中,PD-1抑制剂nivolumab可导致大多数患者HBsAg下降[44]。PD-1抑制剂JNJ-63723283和口服PD-L1抑制剂AB-101目前已分别进入I期临床和临床前试验。

乙型肝炎治疗性疫苗BRII-179的 IIa期临床研究表明,单独使用或与低剂量干扰素-α 联合使用可诱导增强CHB患者的特异性抗体和T细胞反应,但是对病毒学状态影响较小[45]。用于治疗CHB 的免疫原性疫苗的暂未能表现出可靠的疗效,但有研究报道,树突状细胞受体靶向嵌合免疫治疗蛋白[46]在绵羊和人的PBMCs中,可诱导出HBV特异性抗体并增强T细胞反应[47]。通过 T 细胞受体 (TCR) 基因转移或通过使用嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞来实现基因重编程以创建功能性 T 细胞以消除 HBV 感染的肝细胞可能是一种HBV治疗新策[48]。尽管CAR-T细胞疗法会降低发生HCC和肝硬化的机会,但是该治疗方案的生产和实施繁琐、昂贵,对技能人员要求较高,暂时无法替代现有的抗病毒治疗[49]。

慢性乙型肝炎的治疗是困扰全球学者许久的重大问题,而开辟新的治疗靶点,例如NTCP及其底物、宿主PAPD5/7、TDP2以及上调机体免疫反应等,其相关药物已在临床前及临床试验中表现出较好的抗病毒活性,均可以优化现有的治疗方案。慢性乙型肝炎的治愈,重点与难点在于清除HBV cccDNA。因此,更准确与全面的了解HBV复制的分子生物学过程,尤其是cccDNA的产生和降解的影响因素,将是实现乙型肝炎全面治愈的关键。同时,针对HBVDNA、RNA、核衣壳及逆转录酶等作用机制的研究也为新型药物研发提供了较多可靠的治疗靶点依据。有研究表明,相较于单一药物治疗,在核苷(酸)类似物或干扰素疗法的基础上,加用病毒进入抑制剂、核心蛋白变构调节剂和转录抑制剂会具有更好的抗病毒效果[50],而上述新药的研发及新药与现有药物的联合治疗也在加大力度研究中,可以想见未来慢性乙型肝炎治愈的方案必然会是针对病毒与宿主两方面、多靶点,同时更安全更高效。

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