荀苗苗, 袁长春*, 傅凯, 张海燕, 马文兵, 王志强, 李志春
(1.中北大学化学与化工学院, 太原 030051; 2.中北大学德州产业技术研究院, 德州 253034)
对于构成人类健康威胁的癌症,传统的治疗手段都有一定的缺陷[1-4]。基因治疗为一种新型手段,将基因传输到特定细胞,通过促进或抑制目的蛋白表达而治疗人类疾病[5-7]。在基因治疗中,基因载体是其能否进入临床应用的关键[8]。
基因载体分为病毒载体和非病毒载体,病毒载体存在着免疫原性和病毒重组等危险,而且基因组容量有限。与之相比,非病毒载体虽然转染效率有限,但其无传染性、化学结构可调控以及可大量制备等优点,使其越来越受到研究者们的关注[9-10]。阳离子聚合物是近年来非病毒基因载体领域研究的热点,且聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)已成为研究多、发展快、非常有潜力的阳离子聚合物之一[11]。PEI分子量为600 Da～1 600 kDa,低分子量PEI细胞毒性较低,但其转染效率也低;高分子量PEI转染效率高,但其细胞毒性也较高,从而影响了PEI作为基因载体的性能[12],这就需要对它们进行不同修饰。
理想的基因载体需要使复合物到达目标位的同时又能迅速降解,使其有效释放基因而高效表达。因此,降解型聚合物是目前基因载体研究的热点之一[13]。例如,Ghodke等[14]采用由聚乙二醇(PEG)和癸二酸(SA)组成的生物可降解线性脂肪族聚酯及β-环糊精(β-CD)制备的聚轮烷(PRTx+)作为阳离子聚合载体,其具有生物安全性,且与商业转染剂Lipofectamine 3000相当。Lin等[15]研究了利用生物可降解的带电荷聚酯载体BCPVs传递siRNA。能显著抑制肿瘤生长,增强细胞凋亡作用,且未观察到BCPV的显著体内毒性。
疏水性修饰可以提高复合物与膜的融合作用,从而增加细胞内吞,进而提高转染效率。另外,疏水修饰还可以增加载体包裹DNA的能力。因此,疏水性修饰聚合物也是一个研究热点。Chiper等[16]将疏水性水杨酰胺修饰PEI 1.8 kDa,得到的PEI-水杨酰胺能够有效地包裹DNA和RNA,同时能使核酸进入细胞后有效进行释放,结果表明,PEI-水杨酰胺可以作为很好的核酸载体。Zhang等[17]通过α-氨基酸N-羧酸酐(NCA)开环聚合,合成了不同长度的疏水聚(L-亮氨酸)链的两亲性多肽,这些材料与PEI 25 kDa相比具有良好的转染效率,但其细胞毒性不显著。
Xun等18]研究了一系列基于低分子量PEI的生物可降解脂质体聚合物。为了达到与文献[18]同样或更好的效果,又为了避免文献[18]中疏水桥连和生物可降解酯键桥连比例的筛选,以及它们最终聚合物中两种桥连(疏水和酯键)比例的计算。现使疏水基团与酯键处于同一聚酯中,通过采用Michael加成反应将低分子量PEI 600 Da接枝于此疏水性可降解聚酯上形成梳状低聚物用于基因载体。在文中,通过凝胶电泳实验来研究这些低聚物对DNA的包裹能力,并通过绿色荧光蛋白实验来测定部分低聚物/DNA复合物在不同细胞中的转染效率。通过本研究,在分子量相近的情况下,探索出不同疏水链的链长度对基因转染效率的影响。
如图1所示,将反丁烯二酸与疏水桥联化合物1按物质的量之比为1∶1混合于无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液中,以TBAS(癸二酸双(四正丁基)胺)[19]为催化剂,在100 ℃下通过环氧开环反应72 h生成疏水聚酯2。而对于目标聚合物的合成,则是在45 ℃条件下,疏水聚酯2与PEI 600 Da以物质的量之比为1∶1在无水二氯甲烷中回流72 h得到聚合物3。粗产物以甲醇为良溶剂,无水乙醚为不良溶剂沉淀3次来确保聚合物的分散度。采用凝胶渗透色谱(GPC)对聚合物3进行了分子量的测定,结果如表1所示,可以清楚地看到,这些聚合物的分子量都不高,只能称为低聚物,这可能是由于疏水链的空间位阻太大引起的。作者准备在后续研究中先选定三种不同链长的低聚物,研究其与DNA复合物在细胞中的转染情况。
表1 聚合物3的分子量
图1 脂质体聚合物3的合成路线Fig.1 Synthetic route of liposome polymer 3
作为阳离子基因载体,首先必须能与DNA静电相互作用形成纳米复合物。为了研究所合成的脂质体低聚物与DNA的静电相互作用,首先采用凝胶阻滞实验进行研究,结果如图2所示,相比于对照组PEI 600 Da/DNA复合物[图2(a)]在二者质量比大于3.2时才能完全抑制质粒DNA的迁移来说,脂质体低聚物3[图2(b)～图2(j)]在质量比大于1.6时就能够完全包裹质粒DNA,说明所合成的脂质体低聚物能更好地包裹DNA,从而更加有利于复合物与细胞膜的静电相互作用而被细胞内吞。
为了能直观地观察表达了的pEGFP-Nl报告基因的细胞,采用荧光显微镜观察了低聚物(L6-PEI,L12-PEI,L-oleoyl-PEI)/DNA复合物在HEK 293和7402细胞中的绿色荧光蛋白表达,其中“黄金标准”的PEI 25 kDa(质量比为1.4,氮磷比为10)作为平行对照。结果如图3所示,无论是在HEK 293细胞还是7402细胞,(L6-PEI和L12-PEI)/DNA复合物都观察不到转染的细胞,L-oleoyl-PEI/DNA复合物在HEK 293细胞中,只有质量比为6.4[图3(b)]时有少量转染的细胞,但转染细胞的密度远少于标准PEI 25 kDa。L-oleoyl-PEI/DNA复合物在7402细胞中有转染,且在质量比为6.4[图3(e)]时转染的细胞密度与PEI 25 kDa相当,然而本实验使用材料为低聚物且含有可降解酯键,会比标准PEI 25 kDa细胞毒性低。因此,推测此类油酸修饰后的脂质体低聚物有可能作为非病毒基因载体。
图3 L-oleoyl-PEI/DNA复合物在HEK 293和7402细胞中的无血清绿色荧光蛋白表达Fig.3 Fluorescence microscope images of pEGFP-transfected for L-oleoyl-PEI/DNA complex in HEK 293 and 7402 cells in the absence of 10% serum
实验所用试剂及来源见表2。
表2 所用试剂的名称及来源
核磁:Bruker AV 400 MHz核磁共振波谱仪(1H:400 MHz,0.5% TMS为内标);溶剂残余峰校准化学位移:CDCl3:1H NMR=7.26;氢谱分析缩略词:s表示单峰;d表示双峰;t表示三重峰;m表示多重峰;耦合常数(J)单位为赫兹(Hz);琼脂糖凝胶水平电泳仪:美国Bio-Rad公司生产;全自动凝胶成像分析仪:美国Bio-Rad公司生产;恒温CO2细胞培养箱,超净工作台:美国Thermo公司生产;恒温摇床:上海新苗医疗器械制造有限公司生产;倒置荧光显微镜:Nikon Eclipse TE 2000E型仪器。
反丁烯二酸(2.0 mmol)与疏水环氧桥连化合物[18](2.0 mmol)混合于无水二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,加(0.012 mmol)TBAS[19]作为催化剂,在100 ℃下通过环氧开环反应72 h生成疏水聚酯2的粗产物,用氯仿做良溶剂,甲醇做不良溶剂沉淀3次,干燥后得到目标聚酯。
2a(产率23.93%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.94～6.71 (m, 2H, — O2CCHCHCO2), 4.34～4.11 (m, 2H), 4.02 (s, 1H), 3.87～3.78 (m, 1H), 3.69～3.46 (m, 15H), 3.32 (m, 1H), 2.42～2.22(m, 2H, R—H), 1.67～1.53(m, 2H, R—H),1.36～1.23 (m, 4H, R—H), 0.90～0.87 (m, 3H, R—H)。
2b(产率19.26%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.99～6.66 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.31～4.13 (m, 2H), 4.02 (s, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.70～3.45 (m, 15H), 3.35～3.24 (m, 1H), 2.37～2.25 (m, 2H, R—H), 1.65～1.49 (m, 2H, R—H), 1.36～1.17 (m, 8H, R—H), 0.92～0.85 (m, 3H, R—H)。
2c(产率23.14%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.96～6.59 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.37～4.10 (m, 2H), 4.02 (s, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.67～3.40 (m, 15H), 3.36～3.23 (m, 1H), 2.37～2.24 (m, 2H, R—H), 1.58 (s, 2H, R—H),1.33～1.20 (m, 12H, R—H), 0.88～0.85 (m, 3H, R—H)。
2d(产率23.20%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95～6.62 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.39～4.12 (m,2H), 4.03 (s, 1H), 3.87～3.78 (m, 1H), 3.68～3.42 (m, 15H), 3.35～3.25 (m, 1H), 2.38～2.25 (m, 2H, R—H), 1.59 (s, 2H, R—H), 1.35～1.18 (m, 16H, R—H), 0.88～0.85 (m, 3H, R—H)。
2e(产率22.97%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.96～6.69 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.32～4.15 (m, 2H), 4.04 (s, 1H), 3.81 (s, 1H), 3.70～3.43 (m, 15H), 3.36～3.26 (m, 1H), 2.37～2.25 (m, 2H, R—H), 1.58(s, 2H, R—H), 1.32～1.20 (m, 20H, R—H), 0.88～0.85 (m, 3H, R—H)。
2f(产率23.27%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.97～6.62 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.42～4.13 (m, 2H), 4.04 (s, 1H), 3.89～3.76 (m, 1H), 3.77～3.44 (m, 15H), 3.37～3.27 (m, 1H), 2.32 (s, 2H, R—H), 1.59 (s, 2H, R—H), 1.32～1.22 (m, 24H, R—H), 0.89～0.86 (m, 3H, R—H)。
2g(产率23.42%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.98～6.70 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 4.33～4.17 (m, 2H), 4.04 (s, 1H), 3.88～3.80 (m, 1H), 3.69～3.45 (m, 15H), 3.39～3.31 (m, 1H), 2.33 (s, 2H, R—H), 1.59 (s, 2H, R—H), 1.36～1.19 (m, 28H, R—H), 0.89～0.86 (m, 3H, R—H)。
2h(产率23.17%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95～6.69 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 5.40～5.30 (m, 2H, R—H), 4.31～4.15 (d,J=17.5 Hz, 2H), 4.03 (s, 1H), 3.83 (s, 1H), 3.66～3.49 (m, 15H), 3.38～3.27 (m, 1H), 2.39～2.25 (s, 2H, R—H), 2.08～1.91 (m, 4H, R—H), 1.58 (s, 2H, R—H), 1.36～1.17 (m, 20H, R—H), 0.88～0.85 (m, 3H, R—H)。
2i(产率22.91%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.94～6.68 (m, 2H, —O2CCHCHCO2—), 5.40～5.28 (m, 4H, R—H), 4.33～4.15 (m, 3H), 4.04 (s, 1H), 3.86～3.80 (m, 1H), 3.69～3.40 (m, 15H), 3.35～3.25 (m, 1H), 2.78～2.74 (m, 2H, R—H), 2.37～2.26 (s, 2H, R—H), 2.06～2.01 (m, 4H, R—H), 1.59 (s, 2H, R—H), 1.34～1.26 (m, 14H, R—H), 0.90～0.86 (m, 3H, R—H)。
PEI 600(0.38 mmol)和疏水聚酯2(0.38 mmol)溶解在1.0 mL无水二氯甲烷中,在N2氛围下,45 ℃下反应72 h。反应完成后,粗产物溶于少量无水甲醇,用无水乙醚沉淀三次得到目标聚合物3,所收集到的产品经干燥后得无色黏稠液体。聚合物的分子量由凝胶渗透色谱(GPC)测量得到。
L6-PEI(产率13.20%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.85～3,78 (m, 2H), 3.68～3.40 (m, 19H), 2.88～2.41 (m, 56H, PEI600—H), 2.35～2.30 (m, 2H, R—H), 1.65～1.56 (m, 2H, R—H),1.37～1.26 (m, 4H, R—H), 0.89 (t,J=6.9 Hz, 3H, R—H)。
L8-PEI(产率 10.14%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.79 (s, 2H), 3.61～3.50 (m, 19H), 2.79～2.56 (m, 40H, PEI600—H), 2.34～2.27 (m, 2H, R—H), 1.60～1.57 (s, 2H, R—H), 1.36～1.18 (m, 8H, R—H), 0.88～0.84 (m, 3H, R—H)。
L10-PEI(产率11.81%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.89～3.79 (m, 2H), 3.71～3.46 (m, 19H), 2.82～2.51 (m, 40H, PEI600—H), 2.37～2.30 (m, 2H, R—H), 1.67～1.56 (m, 2H, R—H),1.34～1.24 (m, 12H, R—H), 0.89 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。
L12-PEI(产率12.25%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.81 (s, 2H), 3.75～3.52 (m, 19H), 2.90～2.45 (m, 39H, PEI600—H), 2.34～2.31 (m, 2H, R—H), 1.66～1.54 (m, 2H, R—H), 1.37～1.22 (m, 16H, R—H), 0.89 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。
L14-PEI(产率12.33%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.79 (s, 2H), 3.67～3.45 (m, 19H), 2.85～2.44 (m, 44H, PEI600—H), 2.33～2.28 (m, 2H, R—H), 1.63～1.54 (m, 2H, R—H), 1.31～1.20 (m, 20H, R—H), 0.87 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。
L16-PEI(产率11.96%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.83～3.75 (m, 2H), 3.63～3.44 (m, 19H), 2.89～2.43 (m, 33H, PEI600—H), 2.33～2.27 (m, 2H, R—H), 1.64～1.52 (m, 2H, R—H),1.34～1.18 (m, 24H, R—H), 0.87 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。
L18-PEI(产率12.45%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.80 (s, 2H), 3.66～3.39 (m, 19H), 2.91～2.45 (m, 53H, PEI600—H), 2.33～2.27 (m, 2H, R—H), 1.63～1.51 (m, 2H, R—H), 1.34～1.20 (m, 28H, R—H), 0.86 (t,J=6.7 Hz, 3H, R—H)。
L-oleoyl-PEI(产率13.08%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.39～5.29 (m, 2H, R—H), 3.79 (d,J=4.9 Hz, 2H), 3.65～3.52 (m, 19H), 2.86～2.45 (m, 41H, PEI600—H), 2.33～2.29 (m, 2H, R—H), 2.06～2.01 (m, 4H, R—H), 1.64～1.52 (m, 2H, R—H), 1.37～1.18 (m, 20H, R—H), 0.88 (t,J=6.8 Hz, 3H, R—H)。
L-linoleoyl-PEI(产率12.67%):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.40～5.29 (m, 4H, R—H), 3.85～3.75 (m, 2H), 3.63～3.35 (m, 19H), 2.79～2.45 (m, 28H, PEI600—H), 2.33～2.29 (m, 2H, R—H), 2.06～2.01 (m, 4H, R—H), 1.64～1.53 (m, 2H, R—H), 1.34～1.20 (m, 14H, R—H),0.88 (t,J=6.7 Hz, 3H, R—H)。
聚合物溶解在磷酸盐(PBS)缓冲溶液中。相对分子质量由凝胶渗透色谱(GPC)测量得到:Waters 515型仪器,柱温为25 ℃,流动相为含有体积分数为20%乙腈的0.2 mol/L HOAc-NaAc缓冲溶液,流速为0.5 mL/min,标样是窄分布的聚乙二醇,平均分子量为900～80 000。
为了能够形成稳定的复合物,采取等体积复合制备法。先将称量好的低聚物3溶于1 mL去离子水中(做细胞实验时,用0.22 μm的滤膜提前过滤除菌),再用去离子水稀释成不同浓度的低聚物溶液,取一定量的低聚物溶液加入等体积(5 μL)的质粒DNA溶液中,室温条件下复合30 min即可得到不同质量比的低聚物3/DNA复合物溶液。
按照2.5节中复合物的制备方法,制备不同质量比(0.1～6.4)的脂质体低聚物3/DNA的复合物,其中每个样品中pUC19 DNA的量均为0.125 μg。所制备的复合物用PBS稀释到总体积为15 μL,37 ℃孵化30 min后,加入30%(体积比)10×的Loading Buffer混匀。随后将混合液加入已制备好的1%(质量/体积)琼脂糖凝胶孔里,在TBE缓冲溶液中进行电泳实验,电压为150 V。30 min后,在凝胶电泳成像仪下通过紫外光照射观察DNA条带。其中,DNA染色剂为Gelred。
人胚胎肾上皮细胞(HEK 293)采用DMEM培养基培养。人类肝癌细胞(Bel-7402)采用1640培养基培养。培养基中含有体积分数为10%的胎牛血清(FBS),体积分数为1%的双抗(青霉素:100 kU/L;链霉素:100 kU/L),细胞在37 ℃,体积分数分别为5% CO2和95%空气的培养箱中培养。
选取三个低聚物(L6-PEI,L12-PEI,L-oleoyl-PEI)/DNA复合物在HEK 293细胞和7402细胞中进行绿色荧光蛋白表达实验。细胞接种于24孔板中,密度分别为9.5× 104/孔(HEK 293细胞),12× 104/孔(7402细胞),每孔中加入500 μL培养基培养。置于CO2细胞培养箱中培养24 h,待细胞密度为80%～90%即可进行转染实验。
按照2.5节中的制备方法,制备不同质量比的脂质体低聚物(L6-PEI,L12-PEI和L-oleoyl-PEI)/DNA复合物,即将一定量的低聚物溶液和0.8 μg pEGFP-N1复合,用Opti-MEM培养基稀释至100 μL,室温下混匀并静置30 min。进行转染实验前,小心地将24孔板内的培养基吸掉,并加入400 μL新鲜无血清的培养基,再将100 μL复合物溶液加入24孔板中。置于细胞培养箱中培养4～5 h后,再次移去培养基,换成500 μL的新鲜10%血清培养基,CO2细胞培养箱中继续培养,24 h后,在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况并进行拍照。另外,PEI 25 kDa在体内和体外的转染效率均很高,所以将它作为聚合物对照。
(1)成功合成了以低分子量PEI 600 Da为基准,采用Michael加成反应将其接枝于含有疏水链的生物可降解聚酯上的梳状低聚物。
(2)这些低聚物对DNA有较好的包裹能力;且油酸修饰后的脂质体低聚物有作为非病毒基因载体的潜力。
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