核糖体蛋白L4基因表达水平与结直肠癌预后相关性

王 琼, 张 成, 王鑫宇, 张 倩, 刘 洋, 柳云恩

1.沈阳医学院树人国际学院,辽宁 沈阳 110034;2.北部战区总医院 普通外科,辽宁 沈阳 110016

结直肠癌是全球最常见的癌症之一,也是致癌死亡的主要原因[1]。近年来,结直肠癌发病率明显增加,约占所有癌症的10%,是癌症死亡的第二大常见原因,严重危害身体健康[2-3]。尽管早期筛查方法和治疗方案的研究发展有助于显著改善结直肠癌患者预后,但结直肠癌仍然存在较大的健康隐患[4]。虽然,辅助化疗取得了一定效果,但肿瘤的异质性和疾病的危险因素使得结直肠癌患者的临床转归和治疗反应差异很大[5]。因此,通过肿瘤生物学的多样性,筛选更有意义的诊断标志物用于患者风险分层和早期发现,可能会延长结直肠癌患者的总生存期。核糖体蛋白L4(ribosomal protein L4,RPL4)属于核糖体家族,该基因编码核糖体蛋白,是60S亚基的组成部分。有研究报道,核糖体的缺乏伴随着p53通路的激活[6]。RPL4与肿瘤的发生、发展密切相关,RPL4的表达上调与肿瘤患者的预后呈负相关,可促进肿瘤细胞的增殖和分化。Wang等[7]研究发现,过氧化物还原蛋白PRDX2可以结合RPL4,从而阻碍RPL4-MDM2结合,并导致p53降解,促进结直肠癌细胞增殖。但目前关于RPL4在结直肠癌中功能方面的研究报道较少见,RPL4可能是一个具有前景的治疗靶点,可为结直肠癌患者提供个体化治疗,并为临床治疗奠定理论基础。本研究旨在探讨RPL4在结直肠癌患者中的预后价值及生物学意义。现报道如下。

1.1 数据下载及处理 从癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA GDC,https：//portal.gdc.cancer.gov/)数据库中下载结直肠癌及正常结直肠组织的mRNA测序数据和临床信息[8],其中,具有完整信息的有524例结直肠癌患者的mRNA测序,42例患者可进行配对差异分析,417例患者具有完整的总生存期和生存状态,将上述患者的临床数据纳入研究。此外,对mRNA-seq数据的mRNA表达量用log2(UMI+1)进行标准化,并通过其平均值反映映射到多个探针的基因。在本研究中,数据经过质量控制,排除存活时间≤30 d、信息不明确患者的结直肠癌样本。

1.2 RPL4表达情况及生存分析 将TCGA中结直肠癌患者按RPL4 mRNA表达排序,根据其中位值,将结直肠癌患者分为RPL4高表达组和RPL4低表达组。采用“survival”(3.2-13版本)和“survminer”R包进行Kaplan-Meier生存分析,构建RPL4高表达组和低表达组组间的Kaplan-Meier生存曲线,评估RPL4是否为总生存期的预后因素。

1.3 RPL4的单细胞数据分析 在肿瘤免疫单细胞中心(http：//tisch.comp-genomics.org/documentation/,TISCH)进行相关的单细胞分析[9]。分析参数如下：RPL4(基因)、主要谱系(细胞类型注释)和结直肠癌(癌症类型)。通过TISCH内部处理后可视化每种细胞类型中RPL4的表达水平。

1.4 GSEA富集分析 采用GSEA软件,利用从分子特征数据库(MSigDB,https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)下载的京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据集和Hallmark基因集对RPL4高表达和低表达组进行通路富集分析,探讨RPL4在结直肠癌中的生物学功能[10]。将错误发现率<0.25及归一化富集分数的绝对值>2.0定义为截止标准。

1.5 药物敏感性分析 通过国家癌症研究所研究中心建立的Cell Miner数据库下载经过处理后的RNA表达数据(RNA：RNA-seq)和药物数据(Compound activity：DTP NCI-60)[11],选取经过546种临床试验和314种美国食品和药物管理局(food and drug administration,FDA)批准的药物结果。采用最近邻平均impute.knn函数补齐药物缺失数据,采用limma包计算RPL4高表达组和低表达组间的药物敏感性。

1.6 免疫组织化学法 通过在线数据库人类蛋白质图谱Human Protein Atlas(HPA,https：//www.proteinatlas.org/)分析RPL4基因在结直肠肿瘤组织和正常组织中蛋白水平的表达情况[12]。

1.7 实时荧光定量聚合酶链反应 由北部战区总医院普通外科收集20例结直肠癌组织及对应癌旁标本。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测RPL4的mRNA表达水平,按照新一代RNA提取试剂NucleoZOL(MNG,德国,货号：740404.200)说明书步骤提取结直肠组织的总RNA,使用紫外分光光度仪检测mRNA含量。随后采用天根反转录试剂盒,制备20 μl体系cDNA,最终采用天根荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒对cDNA进行PCR反应。引物序列设计如下,RPL4-Forward：AGATGAATTGTACGGCACTTGG,RPL4-Reverse：GACTCTGCGATGGATCTTCTTG;GAPDH-Forward：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG。GAPDH-Reverse：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。PCR反应条件为预变性：95℃、30 s;变性：95℃、10 s,60℃、30 s ,40个循环;退火/延伸：60℃、30 s。记录CT值,按照2-△△CT法计算RPL4在正常结直肠组织和结直肠癌组织中表达的相对水平。

1.8 统计学方法 在线数据统计分析均在R软件(版本4.1.1)(https：//www.r-project.org/)和Perl软件(版本10.0.22000.675)中进行。定量PCR检测采用GraphPad Prism v8.0软件进行统计学分析,组内比较采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 RPL4在结直肠癌中表达上调与较差预后相关 结直肠癌组织样本中RPL4的表达水平明显高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.001,图1a)。将42例配对患者进行差异分析,结直肠癌组织样本中RPL4的表达水平大多高于正常组织(图1b)。生存分析结果显示,将纳入的417例具有完整信息的结直肠癌患者根据中位值将其分为RPL4高表达组和低表达组,低表达组的总生存期明显长于高表达组,差异有统计学意义(P<0.05,图2)。

图1 TCGA数据库数据[a.结直肠癌组织中RPL4的表达高于正常组织;b.在每个患者的肿瘤组织中,RPL4的表达水平普遍高于正常组织;y轴为样本RPL4表达的log2(TPM)值] 图2 RPL4的Kaplan-Meier生存分析结果

2.2 RPL4在结直肠癌中单细胞分析 使用TISCH数据库在GSE166555数据集中分析RPL4在CRC中的13种细胞类型(包括免疫细胞、基质细胞、恶性细胞等)的表达水平(图3),结果发现,RPL4主要表达于恶性细胞和免疫细胞。RPL4在原发性结直肠癌患者的肿瘤微环境中广泛表达于T细胞、B细胞、DC细胞等免疫细胞类型,但在上皮细胞表达较低。

2.3 RPL4在结直肠癌的GSEA富集分析 经GSEA分析发现,在RPL4高表达组的结直肠癌患者中,在Hallmark基因集中主要在MYC和氧化磷酸化通路显著富集(图4a),在KEGG基因集中主要在DNA复制和细胞周期通路显著富集,这些通路与肿瘤的生长、增殖密切相关(图4b)。结果表明,RPL4可能在肿瘤进展中起一定作用。

2.4 结直肠癌中RPL4与药物敏感性的相关性研究 对RPL4高、低表达组进行差异分析,比较组间的药物的半数最大抑制浓度(IC50),结果显示,用于治疗肿瘤的贝利司他、帕博西尼和小分子XR-11576等8种药物的IC50值在RPL4高表达组中显著降低(P<0.05,图5)。结果表明,结直肠癌中RPL4高表达预示着贝利司他和帕博西尼等药物的治疗效果较好。

2.5 RPL4在结直肠癌组织的表达情况 通过HPA数据库提供的结直肠癌组织和正常组织中RPL4蛋白的表达情况发现,与正常结直肠组织比较,结直肠癌组织中RPL4的蛋白表达水平上调,并且主要位于基质细胞(图6)。为了验证RPL4的mRNA表达水平情况,进行qRT-RCR实验,在结直肠癌组织中,RPL4的mRNA表达水平明显高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见图7。

图3 GSE166555中RPL4在13种主要细胞类型中的的表达水平

图4 GSEA分析(a.高RPL4表达组和低RPL4表达组在Hallmark基因集中GSEA分析显示的RPL4表达相关的显著上调通路;b.高RPL4表达组和低RPL4表达组在KEGG基因集中GSEA分析显示的RPL4表达相关的显著上调通路)

图5 RPL4高、低表达组抗肿瘤药物半数最大抑制浓度比较[a.硝酸益康唑(Econazole nitrate);b.贝利司他(Belinostat);c.CUDC-305;d.双氢青蒿素(Artenimol);e.帕博西尼(Palbociclib);f.青蒿素酯(Artesunate);g.XR-11576;h.人参皂苷(RH1)]

图6 RPL4的免疫组化染色结果(a.正常结直肠组织;b.结直肠癌组织) 图7 RPL4的qRT-PCR

结直肠癌被认为是一种遗传性疾病,腺瘤-癌序列是结直肠癌发展的基础。目前,比较认可的靶向和免疫治疗仅在有限的患者亚群中显示出有效性[13]。由于这些原因,越来越需要定义个体患者的分子和生物学景观,实现个体化治疗极为迫切。本研究从多组学途径发现,RPL4是结直肠癌的预后生物标志物,可以有效地预测药物治疗疗效。此外,本研究结果可以为进一步研究RPL4在结直肠癌进展机制中的潜在作用提供一些线索。

首先,本研究基于TCGA数据评估RPL4在结直肠癌中的表达水平,结果显示,与正常结直肠组织比较,结直肠癌组织的RPL4表达水平明显增加,配对差异分析也得到相同的结果,并且在单细胞测序水平上得到验证。然后,本研究对结直肠组织进行了临床样本测试,qRT-PCR结果表明,RPL4在20个结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,进一步验证了RPL4在结直肠癌中的mRNA表达水平上调。在HPA数据库中对RPL4在蛋白水平表达进行验证,免疫组织化学结果显示,RPL4在结直肠癌中的蛋白表达水平上调。上述研究结果表明,RPL4在结直肠癌中表达异常上调,导致癌细胞的生长和增殖,与不良预后相关。

本研究与RPL4相关的潜在药物敏感性分析表明,硝酸益康唑、贝利司他、帕博西尼等对开发RPL4靶点治疗方面显示出巨大潜力。Weng等[14]研究发现,硝酸益康唑是一种抗真菌化合物,在胰腺癌方面有较多研究,益康唑可作为自噬抑制剂抑制肿瘤生长,通过调节ATF3/ID-1/AKT轴刺激自噬启动,同时破坏溶酶体生物发生,从而诱导胰腺导管腺癌细胞中过度的自噬体积累和ER应激介导的细胞凋亡。贝利司他是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,在2014年经FDA认证用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤患者[15]。帕博西尼是CDK4/CDK6的抑制剂,一般与其他药物联合使用,治疗激素受体呈阳性的晚期乳腺癌患者[16]。Sorokin等[17]临床研究发现,MEK抑制剂和CDK4/CDK6的抑制剂联合使用可治疗KRAS突变的结直肠癌患者,提高治疗效果和安全性,并且揭示了靶向治疗的耐药机制。因此,本研究的结果和推导的假设可能为进一步深入研究提供一些线索。

综上所述,核糖体基因RPL4有潜力成为用于结直肠癌诊断和预后评估的新型生物学标志物。本研究初步对RPL4在结直肠癌的表达水平、富集分析和药物敏感性进行研究,表明其作为癌症预后生物标志物的潜在功能及其有效预测药物治疗反应的潜在功能。虽然,本研究通过生物信息学分析确定了RPL4在结直肠癌中的潜在价值,但仍有不足,该项研究无法证明RPL4与这些预测药物的直接相互作用。此外,本研究从在线数据库中收集测序数据进行分析,这不可避免地存在一定的系统误差。笔者认为,该项研究的进一步临床应用和机理研究需要通过实验进行证明。

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