间充质干细胞防治慢性移植物抗宿主病：进展与挑战

鲍颖颖 陈小湧

异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是治疗血液恶性肿瘤的最佳方式。慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease，cGVHD） 是allo-HSCT 后期的主要并发症，发生率呈上升趋势[1]。HSCT 术后有30%～50%的患者发生cGVHD，其中约30%为原发性[1]。cGVHD 可以局限于单个器官或组织，也可能广泛存在，病情常迁延不愈，是导致HSCT 后非复发死亡的主要原因。目前临床一线治疗采用糖皮质激素（激素）或联合免疫抑制药（钙调磷酸酶抑制剂等），但是治疗有效率仅约50%，超过一半的患者在2年内仍然需要二线治疗，然而对于二线治疗或进一步治疗的最佳药物选择尚无共识，且治疗效果往往不尽如人意[2]。因此，寻找和发现适合cGVHD 治疗的新方式已成为当务之急。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群广泛存在于机体多种组织中的多能干细胞，易于分离扩增，具有多向分化潜能、旁分泌效应等，决定了其在损伤修复和组织再生中的广阔应用前景。尤其是MSC 具有多维度、多靶点的免疫调节功能，使其成为治疗免疫相关疾病的重要候选细胞。目前在美国国立卫生院的临床试验网站（www.clinicaltrials.gov）注册的MSC 相关的临床试验超过1 600 项，其适应证主要包括移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮、多发性硬化、炎症性肠炎及糖尿病等。作为最早开展的临床试验之一，MSC治疗移植物抗宿主病的临床研究一直备受关注，大量的临床前和临床研究证实了MSC 可能是cGVHD的有效治疗手段。本文重点关注MSC 防治cGVHD 的研究进展、作用机制及存在的问题及挑战等。

1.1 cGVHD 及其发病机制

cGVHD 的病理生理特征较为复杂，受累器官多样化，临床表现更多变。基于动物模型及临床患者的相关数据，认为cGVHD 的病理生理过程可分为3 个阶段：（1）组织损伤导致的早期炎症；
（2）慢性炎症和免疫紊乱；
（3）组织纤维化。cGVHD 早期阶段因细胞毒性疗法[如放射治疗（放疗）、化学药物治疗（化疗）等]、感染、急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease，aGVHD） 等导致组织损伤，释放的可溶性炎症介质通过Toll 样受体和NOD样受体激活抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC），促进组织炎症反应并介导T 细胞活化。这些炎症介质也会导致血管内皮细胞非特异性损伤，加快了供者免疫细胞向靶器官的迁移。活化的T 细胞分化为辅助性T 细胞（helper T cell，Th）1、Th2、Th17，释放大量炎症因子加重炎症反应，加速cGVHD 的发生[3]。此外，T 细胞介导的组织破坏、钙调磷酸酶抑制剂等的毒性效应可造成胸腺、骨髓等损伤导致中枢耐受破坏，及其介导的调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）、调节性B 细胞（regulatory B cell，Breg）减少诱发外周耐受失调，均可导致自身反应性的T、B 细胞大量产生，加速cGVHD 的发生发展。组织炎症反应可以促进巨噬细胞等活化，通过释放转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β 和血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）-α 等引起成纤维细胞活化和增殖，导致细胞外基质产生，加速纤维化。另外，Th1、Th17 分泌的白细胞介素（interleukin，IL）-13、IL-17 会导致纤维化；
自身反应性抗体的产生会导致致病性免疫球蛋白沉积，加速器官损伤和纤维化[4-5]；
最终表现为累及组织器官的破坏与纤维化（图1）。

图1 cGVHD 主要发病环节Figure 1 Overview of cGVHD pathogenesis

1.2 MSC 及其生物学特性

MSC 最早发现于豚鼠的骨髓中，可以诱导成骨，并且能够支持造血。随后的研究发现MSC 广泛存在于骨髓、脐带血、胎盘、脂肪以及牙髓等组织中。在体外，MSC 以贴壁的形式进行增殖，呈成纤维细胞样形态，表达CD73、CD90、CD105，几乎不表达CD34、CD45、CD11b、CD19及人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR。MSC 可以定向分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，同时还可以调控造血、促进损伤组织修复与再生、重建免疫稳态等。MSC 具有强大的免疫调控活性，可以在微环境中与天然免疫和适应性免疫细胞相互作用，调控免疫平衡。既往的研究证实MSC 主要通过细胞间接触、分泌可溶性因子及胞外囊泡等方式发挥免疫调控作用：抑制T 细胞增殖、抑制Th1 和Th17 的分化，诱导Treg 的产生；
调节B 细胞的增殖分化及抗体产生的能力，诱导Breg 产生；
下调自然杀伤（natural killer，NK）细胞、树突状细胞的活化，诱导M1 型促炎巨噬细胞向M2 型抗炎巨噬细胞极化[6-7]。

正是由于MSC 多维度、多靶点的免疫调控功能，MSC 成为了防治cGVHD 重要候选细胞。自2004年Le Blanc 团队首次使用半相合的MSC 成功治疗了1 例严重的激素难治性aGVHD[8]，大量的临床前和临床研究证实了MSC 治疗移植物抗宿主病（graftversus-host disease，GVHD）的安全性和有效性[9]。目前使用MSC 预防或治疗GVHD 的临床试验超过60 项（www.clinicaltrials.gov）；
加拿大、新西兰、日本等国家先后批准MSC 作为上市药物来治疗GVHD。

1.3 MSC 预防cGVHD

cGVHD 作为难治性疾病，预防其发生显得尤为重要，MSC 是否可以作为cGVHD 预防策略备受关注，多项临床研究应运而生。2011年一项随机对照试验显示，造血干细胞移植前24 h 内输注MSC 可以降低cGVHD 的发生率[10]；
随后两项儿童cGVHD的临床研究结果表明，MSC 与脐带血共移植组中均无患者发生cGVHD，而对照组中则分别有17%和10%的患者发展为cGVHD[11-12]。近年3 项多中心随机临床试验也证明了MSC 可以安全、有效地降低cGVHD 的发生率[13-15]。令人兴奋的是，2018年至2021年间，4 项meta 分析的结果都表明，MSC 输注可以有效降低cGVHD 的发生率[16-19]。综上所述，MSC 预防cGVHD 是可行、有效的，当然，目前也存在一些争议，MSC 预防cGVHD 的同时是否影响疾病复发率和患者生存率报道不一（表1）[10,13-15,20]，MSC 来源、输注剂量、治疗时机等是否与cGVHD 的预防效果有关仍有待更多的临床研究来阐明。

表1 MSC 预防cGVHD 的临床现状Table 1 The clinical status of MSC in prevention of cGVHD

1.4 MSC 治疗cGVHD

由于cGVHD 现有治疗手段的疗效差强人意，MSC 作为cGVHD 新型细胞治疗方式备受期待，随着MSC 在治疗aGVHD 获得成功，MSC 也陆续被运用于cGVHD 的治疗。MSC 治疗cGVHD 最早被报道于Müller 等[21]的研究，该研究共入组3 例cGVHD 儿童患者，MSC治疗后仅1例有轻微改善。随后，Weng等[22]在MSC 治疗难治性cGVHD 的研究中发现，73.7%的患者对MSC 反应良好，14 例存活患者中有5 例可逐渐减少免疫抑制药的用量，5 例可停用免疫抑制药，且2年生存率达到77.7%。Jurado 等[23]在2017年报道了使用脂肪来源的MSC 治疗cGVHD，结果显示入组患者无严重不良反应发生，整体生存率达71.4%，大部分患者在治疗后完全缓解。Le Blanc 团队在2020年报道了11 例MSC 治疗严重难治性cGVHD 的案例，其中，6 例患者症状及生活质量得到了持续性改善，2 例患者停用了免疫抑制药，另外2 例患者停用了激素，并且逐渐减少了钙调磷酸酶抑制剂的用量[24]。2022年的一项MSC 治疗激素难治性cGVHD临床试验发现，有65.5%的cGVHD 患者对MSC 有反应，2年生存率为70%；
其中儿童患者的反应更好，75%对MSC 有反应[9]。meta 分析结果表明MSC 治疗后cGVHD 患者的生存率为64%，但因为临床试验较少，多数研究中缺乏对照组，疗效的系统性评估仍有赖于大型的多中心对照研究的开展[17]。此外，MSC也被报道在治疗cGVHD 相关的干眼症、闭塞性细支气管炎等取得较好的效果[25-26]。目前关于MSC 治疗cGVHD 的临床应用见表2[9,22-24,27-29]。

表2 MSC 治疗cGVHD 的临床现状Table 2 The clinical status of MSC treatment for cGVHD

尽管大量的临床研究已经证实MSC 预防及治疗cGVHD 的安全性和有效性，但MSC 防治cGVHD 的作用机制仍知之甚少。结合cGVHD 的发病机制以及MSC 治疗cGVHD 相关研究结果，MSC 防治cGVHD的作用可以归纳为以下3 个方面。

2.1 调控免疫耐受

免疫耐受的失衡与cGVHD 发生发展密切相关，尤其是胸腺、骨髓等损伤导致中枢免疫耐受和外周免疫耐受破坏加速了cGVHD 的进程。研究发现MSC治疗可以恢复中枢、外周免疫耐受。黄晓军团队在2011年报道MSC 治疗后患者血浆中基质细胞衍生因子（stromal-derived factor，SDF）-1α、促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、IL-11 升高，提示MSC 可能通过分泌这些造血刺激因子促进血小板存活，从而招募CD34+造血干细胞，提供支持造血的微环境，促进正常细胞发育[10]。小鼠模型的研究发现CCR9+MSC 可以促进小鼠胸腺上皮细胞的增殖及成熟，减少其凋亡，同时也增加了胸腺CD4+CD8+T细胞及Treg 的比例，提示MSC 可以促进胸腺结构及功能的恢复，减少cGVHD 的发生[30]。MSC 来源的外泌体能够抑制CD4+T 细胞向肺部迁移和浸润，降低脾脏及淋巴结Th17 的比例，诱导Treg 产生，减少IL-17A、IL-21、IL-2 等炎症因子的释放，延长cGVHD 小鼠的生存期，改善其病理损伤[31]。临床研究同样发现MSC 治疗后CD4+CD25+CD127-Treg 数量显著增加，NK 细胞减少[13]，提示MSC 能够通过抑制效应T 细胞，诱导Treg 恢复外周免疫耐受。

2.2 恢复B 细胞稳态平衡

越来越多的研究表明B 细胞在cGVHD 的免疫病理与组织损伤中具有至关重要的作用。多项报道显示，cGVHD 患者骨髓中前体B 细胞减少；
外周血B细胞亚群组成异常，如CD21lowB 细胞显著增加，过渡期B 细胞、初始B 细胞减少[32]，Breg 减少[33]；
次级淋巴器官中前生发中心（pre-germinal center，pre-GC）B 细胞、CD27+B 细胞及浆细胞样的B 细胞比例增加[34]；
此外，cGVHD 患者血浆B 细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）水平异常升高，促进自身反应性B 细胞的存活及分化[35]，导致B 细胞稳态失衡。近年的临床试验提示B 细胞可能是MSC治疗cGVHD 的关键细胞靶点。MSC 治疗cGVHD后，血浆BAFF 水平降低，BAFF/B 细胞比值明显下降，记忆性B 细胞、pre-GC B 细胞[13,27]、表达IL-10的CD5+Breg 的比例显著增加[28]，此外，MSC 治疗cGVHD 的持续性疗效也与初始B 细胞等的增加有关[24]，提示MSC 治疗可以通过影响BAFF 水平等减少自身反应性B 细胞的产生、促进正常B 细胞的发育（初始B 细胞、记忆性B 细胞等增加）和诱导Breg 等方式恢复B 细胞稳态平衡，抑制cGVHD 的发生发展。

2.3 抑制纤维化进程

组织纤维化主要是由长期反复的炎症、细胞质基质及胶原蛋白的异常沉积所形成，也是cGVHD 患者器官损伤或衰竭的重要原因。临床试验显示，MSC的治疗能够增加Th1/Th2 的比例，而Th2 的比例增加被认为是纤维化发展的重要因素[36]，提示MSC 可能通过调节Th1/Th2 的平衡来抑制纤维化。MSC 来源的外泌体也可以通过抑制皮肤巨噬细胞的浸润、TGF-β 及Smad2 的产生来缓解皮肤纤维化，进一步缓解硬皮病cGVHD 小鼠的症状[37]。炎症和免疫反应是纤维化的基础，固有免疫细胞和适应性免疫细胞都有参与。基于MSC 广泛的调控能力，MSC 可能通过抑制巨噬细胞、效应性T 细胞分泌炎症因子，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干扰素（interferon，IFN）-γ、IL-13 和IL-17 等，抑制B细胞分泌抗体等来实现对纤维化的缓解[38]。

目前MSC防治cGVHD展现巨大的临床应用前景，MSC 有望成为cGVHD，特别是难治性cGVHD 的有效治疗手段，当然，我们也不能忽视在cGVHD 防治中MSC 的疗效存在不稳定的现象，究其原因，可能与MSC 的选择、输注剂量和时机、患者的特征等密切相关[39]。

3.1 MSC 的功能异质性

MSC 是一群异质性的细胞，存在功能的差异，可以表现为不同个体来源的MSC 存在功能差异，同一个体不同组织来源MSC 的功能不同，同一组织来源MSC 存在不同的功能亚群，这些均可以导致MSC治疗效果参差不齐[40]。如有研究报道来源于10 岁以下供者的MSC 治疗aGVHD 后1年存活率显著高于10 岁以上供者的MSC 治疗组[41]，目前cGVHD临床防治中骨髓MSC、脐血MSC 和脂肪MSC 等也存在疗效的差异[9,16,23]。Tago 等[42]近来发现人羊膜来源的MSC 也能够抑制T 细胞的活化与增殖，延缓aGVHD 的疾病进程。因此，获得适合cGVHD 防治MSC 显得尤为重要，基于MSC 防治cGVHD 的作用机制，具备较强免疫调控能力的MSC 亚群可能更适合cGVHD 的防治。相关研究显示次级淋巴器官来源的MSC 具有更强的免疫调节功能，且在肠道炎症疾病治疗中展现更好的疗效[43]。CD146highMSC 能更有效地抑制T 细胞的活化，增强CD11bhigh髓系细胞的吞噬作用，改善小鼠aGVHD[44]。低表达转录因子Twist1 的MSC 抑制T 细胞增殖的能力更强，对于博来霉素诱导的损伤保护效果更好[45]。上述研究成果将为后续获得适合cGVHD 防治的MSC 亚群提供重要基础。此外，可以基于MSC 防治cGVHD 的作用机制，针对性改造MSC，获得适合cGVHD 防治的功能增强型MSC。

3.2 MSC 输注的剂量与时机

MSC 防治cGVHD 的临床研究中，MSC 的使用剂量范围较大[（0.01～65.00）×106/kg]，注射次数及间隔时间也各不相同，这可能也是MSC 治疗效果存在差异的主要原因之一。Stenger 等[29]对比了3 种输注方案（2×106/kg，1 周1 次、1 周2 次、1 周4 次）MSC 的治疗效果，发现3 种输注方案的MSC 均耐受性良好，未发生剂量限制性毒性，且外周血淋巴细胞亚群差异无统计学意义。meta 分析中，Wang 等[16]认为高剂量、晚输注能更有效地预防cGVHD 的发生，但是Morata-Tarifa 等[17]则认为GVHD 的预防与MSC 的剂量无显著相关性。此外，同一来源的MSC在不同患者间也存在疗效差异，儿童患者的预防及治疗效果优于成年患者[9,16]；
皮肤GVHD 的治疗总生存率及总反应率高于胃肠道及肝脏GVHD[17]，也有研究认为肺部cGVHD 预防效果更好[13]；
且中度比重度cGVHD 治疗效果好[46]。因此，未来仍需大量的临床试验来分层研究MSC 的最佳使用剂量、介入时间、给药频率及cGVHD 适应证，在避免不良反应的基础上最大程度发挥MSC 的治疗效果。

3.3 MSC 疗效评估体系

目前cGVHD 的诊断与疗效评估主要是根据2014年美国国立卫生研究院的cGVHD 相关标准，很大程度是依赖于组织器官损伤的表现，因此不能在早期发现cGVHD 或预判治疗效果，而生物标志物的发现有助于cGVHD 的诊断，预测或评估其治疗效果，甚至更深刻地理解临床现象背后的病理生理过程。目前，cGVHD 预测及诊断的生物标志物主要包括细胞和可溶性分子两大类。其中，血浆肿瘤发生抑制因子（suppression of tumorigenicity，ST）2、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3、CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）9和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）可以作为一组因子来预测HSCT 100 d 后3 个月内cGVHD 的发生；
CD19+CD21lowB 细胞的升高、CD56bright调节性NK细胞的减少、血浆BAFF 水平及BAFF/B 细胞比例的增加、CXCL9、CXCL10 的水平升高等被认为与cGVHD 的发生密切相关，是潜在的cGVHD 诊断标志物的候选指标，同时，血浆BAFF 水平及BAFF/B细胞比例也可以用作cGVHD 预后的预测因子[47-48]。然而，这些cGVHD 相关的生物标志物是否适合用于评价MSC 疗效仍不清楚，仅有个别研究发现MSC 治疗后患者血浆CXCL9、CXCL10 及BAFF 的水平显著降低，认为这三者可以作为MSC 预后有效性的生物标志物[24,27]。MSC疗效评价的生物学标志物的发现，不仅有助于早期预测MSC 疗效、及时调整治疗策略，也可以根据生物学标志物选择合适的MSC、优化治疗效果，甚至是根据生物学标志物建立筛选体系，对患者进行分层治疗，提高治疗效果。因此，探索高质量的反映MSC 治疗有效性的cGVHD 生物标志物迫在眉睫。

综上所述，MSC 是一种预防及治疗cGVHD 安全且有效的方式，但如何实现MSC 精准防治cGVHD、提高治疗效果仍是亟待解决的科学问题。为了能更好地发挥MSC 的治疗效果，仍然有必要继续进行基础研究及大型、多中心的临床试验，从MSC 的异质性、患者状况、治疗方案以及疗效评估体系等方向出发进一步优化MSC 的治疗效果。如探索MSC 的供者、组织来源及体外培养方式对MSC 免疫调节功能的影响；
筛选适合cGVHD 防治的MSC 优势亚群；
增强MSC 的靶向性；
规范临床应用中MSC 的介入时间、注射剂量、次数及间隔时间；
寻找可以预测或者调控MSC 治疗有效的生物标志物等，为建立MSC 防治cGVHD 精准策略奠定基础。

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