基于网络药理学及分子对接探究银杏叶干预糖尿病心肌病的作用机制

孔一晗，董亚，常柏

（1.天津医科大学研究生院，天津 300070；
2.天津医科大学朱宪彝纪念医院，天津市内分泌研究所国家卫健委激素与发育重点实验室，天津市代谢性疾病重点实验室，天津 300134）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是在患有糖尿病的人群中，排除了缺血性心脏病以及高血压之后，仍存在明显心肌结构及功能改变的特异性心脏病[1]。DCM 作为一种糖尿病常见并发症，其病因、发病机制比较复杂。临床结果表现为充血性心力衰竭、心源性休克，甚至猝死[2]。在我国，由糖尿病所致的心力衰竭发病率从1993年的12.3%增长到2007 的22.1%，糖尿病是除冠心病、高血压之外导致心力衰竭最主要的原因[3]。银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶[4]。有文献报道银杏叶治疗DCM有着明确的疗效，可以减轻氧化应激损伤，抑制炎症反应等[5-8]，但详细机制尚未明确，因此借助大数据分析，通过网络药理学平台探究银杏叶治疗DCM的靶点通路具有重要意义。网络药理学融合生物学、药理学、计算机科学等多学科知识，基于“疾病-基因-靶点-药物”的构建，进行综合网络分析[9]。其与整体观、辨证施治的传统中医学思想具有异曲同工之处[10]。本次研究采用网络药理学的分析方法，从分子水平探讨了银杏叶抗DCM 的潜在作用机制，为进一步探究银杏叶防治DCM 提供了方向和思路，进而指导临床实践。

1.1 银杏叶的作用靶点预测 通过中药系统药理学数据库和分析平台[11]TCMSP，以口服生物利用度OB 值≥30%、类药性DL 值≥0.18 为筛选条件筛选出银杏叶的活性化学成分，使用UniProt[12]数据库对活性成分对应的蛋白名称进行转化，统一格式以便进行下一步的操作。

1.2 DCM 疾病靶点的构建 以“Diabetic cardiomyopathy”为关键词，在人类基因数据库GeneCards[13]，OMIM[14]、Disgenet 数据库中，收集汇总DCM 的相关靶点。

1.3 银杏叶治疗DCM 的潜在靶点预测及蛋白相互作用（PPI）网络构建 利用Venny 2.1.0 绘制交集靶点，得到疾病和药物的交叉靶点。将共同靶点导入STRING 平台[15]，物种选项设定为“Homosapiens”，并将靶点之间的最低联系数值按系统默认值0.400 设定[16]，构建银杏叶与DCM 交集靶点的互作网络。把PPI 网络文件导入Cytoscape 软件[17]中，进行可视化分析。拓扑学分析插件NetworkAnalyzer 对靶点进行重要性检测，通过度值（DC）、介数中心值（BC）和紧凑度（CC）对相关节点的重要性进行评价，以大于各个值的中位数为条件筛选得到关键目标基因。度值代表有多少边与节点相连，介数中心性表示互作图中某节点上的最短路径通过此节点的整个路径数量的比例，紧密中心性也称接近中心性，即一个节点在整个结构中所处的位置[18]。节点对应的以上参数值越大，则代表该节点在整个网络中起到的作用越大。

1.4 “核心靶点-关键化合物”的构建 利用Cytoscape 软件，将筛选出的交集靶点中的核心靶点与其对应的化合物进行作图，构建化合物-靶点相互作用图。

1.5 GO 富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析 将银杏叶与DCM 的交集靶点导进DAVID（生物学信息注释）数据库[19]，设置物种为“Home Sapiens”，选定生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）进行银杏叶干预DCM 靶点的GO 富集分析；
选中KEGG 进行信号通路分析。以P＜0.05 为筛选条件，P 值越小，其统计学意义越大，将P 值进行升序排列，筛选出差异显著的GO 功能过程和可信的信号通路。应用微生信软件对筛选结果进行可视化分析，并用条形图和气泡图展示筛选结果。

1.6 构建“疾病-靶点-通路”网络 将疾病名称、筛选出来的疾病靶点以及KEGG 富集到的20 条关键通路进行网络构建，更加直观的体现三者之间的相互作用关系。

1.7 分子对接验证 分析PPI 网络中排名前3 的靶点，即银杏叶作用于DCM 的关键核心靶点，并与其对应的银杏叶相关化合物进行分子对接验证。利用TCMSP 数据库下载化合物的结构，利用Chem 3D 20.0 软件进行3D 转换并进行能量优化。使用PDB 数据库将关键靶蛋白的结构下载下来，去水、加氢处理之后以pdbqt 格式的文件保存。利用AutoDock Vina1.1.2 软件[20]将关键化合物与3 个核心靶点进行分子对接分析。AutoDock Vina 运算速度快、精准性较强，已被广泛应用于分子蛋白的对接领域[21]。

2.1 银杏叶的作用靶点预测 通过TCMSP 数据库检索得到银杏叶活性成分307 种，通过口服生物利用度OB 值和类药性DL 值筛选得到活性成分27种。采用Uniprot 蛋白质数据库将靶点统一规范为Gene Symbol，舍去7 个无相应靶点的活性成分，并删除重复靶点，最终获得20 个药物活性成分靶点，具体成分见表1。

表1 银杏叶主要化合物及相关OB、DL 值Tab 1 Main compounds of ginkgo biloba leaves and their OB and DL values

2.2 DCM 疾病靶点数据库的构建 以“Diabetic cardiomyopathy”为关键词，在GeneCards、OMIM、Disgenet 数据库全面检索，共获取5 496 个靶点，GeneCards 中4 799 个靶点，OMIM 中477 个，Disgenet 中220 个。在GeneCards 中设定Relevance score≥10 的靶点为DCM 的重要靶点，结合OMIM、Disgenet 数据库加以补充，并删除重复靶点，最后获取到1 181 条靶点信息。

2.3 银杏叶干预DCM 的靶点预测 将银杏叶的相关靶点及DCM 的主要靶点导进Venny 软件，两者取交集，可见其共同靶点有91 个，见图1。

图1 银杏叶-DCM 靶点交集Fig 1 Ginkgo leaf-DCM target intersection

2.4 PPI 网络的构建分析 为获取蛋白质间的相互作用关系，将药物疾病的91 个交集靶点基因导入STRING 数据库构建互作网络，将与其他靶点无链接的靶点隐藏后，共有90 个节点，1 645 条边，边的数量越多说明其相互作用越强，见图2。利用Cytoscape 软件，制作蛋白基因互作网络图，如图3 所示，通过节点的面积和颜色体现度值的大小，即面积越大、颜色越深，则代表度值越大。利用软件中的Network Analyzer 插件对网络进行拓扑参数分析，以节点度值、介数中心性以及紧密度对节点的重要性进行分析，以大于中位数为条件筛选出了11 条核心靶点，包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）1、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子A（VEGFA）等，其中度值最高的前3 个为Akt1、TNF、IL-6，推测可能在银杏叶干预DCM 过程中起主要作用，见表2。

图2 交集靶点PPI 网络Fig 2 Intertarget PPI network

图3 交集蛋白互作图Fig 3 Intersection protein interaction diagram

表2 核心交集靶点Tab 2 Core intersection targets

2.5 “核心靶点-关键化合物”的构建 将核心靶点以及对应的化合物成分导入Cytoscape 进行作图，构建化合物-靶点相互作用图，如图4。

图4 中药化合物-核心靶点相互作用图Fig 4 Diagram of traditional Chinese medicine compound - core target interaction

2.6 银杏叶作用于DCM 靶点的GO 富集分析 对91 个交集靶点进行BP、CC 和MF 分析。分析得到BP 条目2 386 个，CC 条目133 个，MF 条目162 个。分别按P＜0.05 为标准进行筛选并升序排列，取前20 条进行可视化分析，三合一条形图及气泡图分别如图5～8 所示。结果显示，银杏叶干预DCM 的靶点主要富集在对含氧化合物的反应，凋亡过程的调控，对内源性刺激的反应，细胞死亡以及细胞内信号转导等生物过程；
细胞组分主要包括膜微区、内质网、胞外区、囊泡、膜筏、陷窝等；
在分子功能上，涉及了受体结合、酶结合、细胞因子活性、磷酸酶结合、转录因子结合、生长因子受体结合、蛋白激酶结合等。

图5 GO 分析BP CC MF 三合一柱状图Fig 5 GO analysis BP CC MF 3-in-1 histogram

图6 GO-BP 气泡图Fig 6 GO-BP bubble diagram

图7 GO-CC 气泡图Fig 7 GO-CC bubble diagram

图8 GO-MF 气泡图Fig 8 GO-MF bubble diagram

2.7 银杏叶对DCM 相关靶点KEGG 信号通路富集分析 使用DAVID 数据库进行KEGG 信号通路分析，以P＜0.05 为条件筛选出152 条主要通路。对P值进行升序排序，取前20 个代表性通路进行可视化气泡图分析，见图9，结果显示，银杏叶抗DCM 的通路主要集中在糖尿病并发症中的AGEs-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路以及癌症相关通路等信号通路。

图9 KEGG 信号通路气泡图Fig 9 Bubble diagram of KEGG signaling pathway

2.8 构建“疾病-靶点-通路”网络 利用Cytoscape软件将导入的疾病、疾病相关靶点、KEGG 信号通路进行作图，见图10，其中红色DCM 代表DCM，紫色代表信号通路，黄色表示靶点。

图10 疾病-靶点通路互作图Fig 10 Diagram of disease-target pathway interaction

2.9 分子对接验证 依据2.4 中筛选得到的度值前三的核心靶点Akt1、TNF、IL-6，利用Autodock对化合物与关键核心靶点进行半柔性分子对接测试。相关证据表明，结合自由能低于0 表示受体和配体可自发结合，结合能越低则说明二者的结合力越强，当结合能＜-5.0 kcal/mol 时，结合能力较强[22]。如表3 所见，3 组对接的结合自由能皆＜-5.0 kcal/mol，chryseriol（金圣草黄素）与Akt1、TNF，stigmasterol（豆甾醇）与IL-6 均有较好的结合活性。对接可视化图像如图11～13 所示，图11 中chryseriol 与Akt1的LEU-110、TRP-80 形成氢键，氢键的长度分别为2.8Å、3.0Å，这些残基可能是chryseriol 作用于Akt1的关键残基；
图12 中chryseriol 与TNF 的PRO-100、GLU-116、ARG-98、PRO-113 形成氢键，氢键的长度分别为2.7Å、3.1Å、3.1Å、3.1Å，这些残基可能是chryseriol 作用于TNF 的关键残基；
图13 中stigmasterol 与IL-6 的ASP-34 形成氢键，氢键的长度为3.5Å，这些残基可能是stigmasterol 作用于IL-6 的关键残基。

图11 金圣草黄素与Akt1 分子对接图Fig 11 Molecular docking diagram of chryseriol and Akt1

图12 金圣草黄素与TNF 分子对接图Fig 12 Molecular docking diagram of chryseriol and TNF

图13 豆甾醇与IL-6 分子对接图Fig 13 Molecular docking diagram of stigmasterol and IL-6

表3 分子对接结果Tab 3 Molecular docking results

李艳等[23]将桑白皮中的槲皮素与Akt1 的TRP-80 结构进行对接，通过苯环与底物的共轭结构之间的π-π 相互作用，更好的结合到了Akt1 的活性中心，与本文中金圣草黄素与Akt1 相结合的位点一致，且结合自由能均在-5.0 kcal/mol 以下。另有实验表明，补阳还五汤中的山奈酚与Akt1 的结合能为-7.8 kcal/mol[24]，丹蛭降糖胶囊中水蛭中的藏花酸与Akt1 的结合能与本文中金圣草黄素与Akt1 的结合能一致，均为-6.1 kcal/mol[25]，这表明Akt1 是糖尿病治疗的关键靶点，可与多种化合物较好的结合。彭泽等[26]在洋参御唐方中检索出化合物成分豆甾醇，也将之与核心靶点IL-6 进行对接，结合能为-8.5 kcal/mol。相关研究得出，豆甾醇与TNF 的结合能为-28.87 kJ/mol，换算后为－6．9 kcal/mol[27]。比本文中金圣草黄素与TNF 的结合能略小，说明金圣草黄素与蛋白分子TNF 的结合更加紧密，猜测其药物疗效也更好。

DCM 的发生与糖脂代谢紊乱、心脏胰岛素信号受损、晚期糖基化终末产物积累、炎症等病理过程紧密相关[28－29]。目前对于DCM 的治疗主要以使用降糖药、胰岛素和促胰岛素分泌剂、β 受体阻断剂等传统西药为主，均存在一定的不良反应并易产生药物依赖性[30]。现代实验表明，中药单药及复方治疗DCM 有着较为显著的疗效，如柚皮苷可通过减轻心肌的氧化应激水平，抑制细胞凋亡从而产生心肌保护作用[31]。银杏叶具有活血化瘀、通络止痛的功效，其有效成分主要包括内酯类、黄酮类化合物[32]，常用于治疗胸痹心痛、瘀血阻络、高脂血症等。

本研究通过构建PPI 互作网络，进行拓扑学分析并筛选得到银杏叶干预DCM 的核心作用靶点，分析结果表明，银杏叶抗DCM 的作用机制与Akt1、TNF、IL6、VEGFA、TP53 等靶点密切相关。为进一步明确化合物与核心靶点的结合能力，通过分子对接技术对排名前3 的靶点与其对应的化合物金圣草黄素、豆甾醇进行对接实验，实验结果显示各组结合能均＜－5．0 kcal/mol，表明两两结合活性较好，结合力较强。Akt1 是Akt 家族的成员之一，可以调节代谢、生长增殖、细胞存活及血管生成[33]。是糖尿病代谢紊乱经典通路PI3K－Akt 中的成分之一。相关研究显示，在脂肪细胞分化进程中，强烈抑制Akt1 会影响脂肪转录程序的激活，从而造成脂肪的累积[34]。由此考虑糖尿病患者可能因心肌脂肪增加导致肌肉收缩能力下降，加重心肌病变，而银杏叶的活性成分则通过上调Akt1 的表达改善心肌病变。白羽等[35]也通过动物实验验证了中药干预的DCM 大鼠体内p－Akt 含量显著上升。炎症是糖尿病发生、发展的重要机制之一，此次分析得到的核心靶点中有3 个属于炎性因子，TNF－α 由单核细胞及巨噬细胞分泌产生，可诱导细胞损伤，参与免疫反应，研究表明，心肌炎症可通过降低TNF－α、IL－6 的水平来抑制[36]。IL－6 在炎症、损伤、免疫应答中均担任重要角色，高水平的IL－6 可减少胰岛素释放，胰岛素分泌不足造成高血糖又反过来刺激胰岛β 细胞产生较多IL－6[37]，如此恶性循环。血管内皮生长因子（VEGF）家族是血管新生的重要调节因子，其中VEGFA 最受关注[38]，是心肌病变的重要预测靶点。

KEGG 富集结果表明，银杏叶治疗DCM 的作用机制可能与糖尿病并发症AGEs－RAGE 信号通路、脂质与动脉粥样硬化、IL－17 信号通路、TNF 信号通路、HIF－1 信号通路等密切相关。Akt1 在17 条通路上富集，是核心靶点中富集通路最多的基因，同样提示Akt1 是参与改善心肌病病变的关键因子之一。除此之外，TNF－α、IL－6、IL－1β 富集的通路也均在10 条以上。AGEs－RAGE 信号通路通过激活核转录因子－κB 产生促炎因子（IL－6、TNF、IL－1β 等）及黏附因子，引起慢性损伤，造成心肌病的加重。氧化应激作为DCM 发生、发展的主要分子机制之一，是促成DCM 进展的“引火线”[39]，IL－17 信号通路与炎症密切相关，心肌病变也被证实由炎症及氧化应激介导形成，IL－6 等靶点也是通过此信号通路调节炎症来干预DCM。TNF 信号通路可通过诱导细胞凋亡的途径，破坏心肌纤维组织，造成糖尿病心肌纤维化病变，而银杏叶的活性成分可通过抑制此通路的表达起到保护心肌组织的作用。另外也有研究报道，DCM 表现为细胞因子TNF－α 和TGF－β1 的表达增加[40]。与本研究结果一致。

当前对于应用银杏叶单味药干预DCM 的文献报道较少，曹鹏飞等[6]通过动物实验得出主要成分为黄酮类和萜内酯类的银杏叶提取物可调节血糖并改善心肌损伤，与本文中黄酮类化合物金圣草黄素作用于炎性因子的机制一致。另有研究发现，银杏叶提取物可降低活性氧簇、乳酸脱氢酶等水平，减轻心肌损伤[41]。在体外细胞实验中也验证了银杏叶提取物通过丝裂原活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径能够减少高糖诱导的H9C2 细胞凋亡[42]。王晓梅等[5]研究显示，与对照组相比，银杏叶提取物可有效降低DCM 患者VCAM－1、ICAM－1 浓度，改善血液循环及炎症。本研究应用网络药理学技术，对银杏叶干预DCM 的关键作用靶点进行全方位的预测和分析，通过分析结果并结合相关文献报道，发现银杏叶可能通过Akt1、TNF、IL－6、VEGFA、TP53 等靶点，在IL－17 信号通路、TNF 信号通路、糖尿病并发症中AGE－RAGE 信号通路等作用下干预DCM。并且分子对接显示，与关键核心靶点对应的化合物主要有金圣草黄素和豆甾醇，提示其主要是通过这两种化合物作用于心肌组织，减轻炎症和氧化应激水平，抑制心肌细胞凋亡，从而发挥疗效。本次研究基于线上数据库进行挖掘，具有一定的参考价值，但后期尚需通过实验验证结论的可靠性。

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