科洛火山小椅山火山灰细菌多样性及其与环境因子的关系

贺双俊，杨健，刘涛，张爽，王伟东，晏磊

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院/黑龙江省寒区环境微生物与农业废弃物资源化利用重点实验室，大庆 163319）

火山活动被定义为行星或卫星周围伴随固体、液体或气体释放而产生的内部热运动。随着火山地质运动过程，形成了许多丰富多样的极端山体地貌微环境，从酸性温泉到深海以及内陆玄武岩栖息地。由于火山环境在地球上广泛分布，了解火山环境中微生物生命的多样性和特征具有重要的地质学意义。火山环境可以作为模型系统来理解原核生物多样性和分布特征的典型模式。这些研究提高了我们对火山岩石与板块俯冲和碰撞相关的地质活动演替对地壳的生长的决定作用[1-2]，为深入认识地球化学环境对地球表面和地下微生物多样性主要影响。因此，探索火山环境的微生物多样性有助于揭示地球上存在的早期微生物生命的潜力。近年来，许多研究表明，火山喷发活动不仅影响局部乃至全球的生态系统和气候，而且由于火山灰对环境生态系统的影响，对环境生态系统能够产生重要的生态环境效应。这也有助于深入挖掘地质历史时期火山喷发的火山灰层中的新细菌资源[3]，为了解火山环境的微生物多样性和碳氮元素的全球循环提供重要的核心思路[4-5]。在伴随着火山地质活动演替形成的山体地貌可能会因为生物活动而发生不同程度显著的变化，最近研究表明夏威夷基拉韦厄火山（KVD）沉积环境中具有丰富的细菌多样性，而且大部分微生物多样性多基于与环境样品未培养的微生物或特定的16S rRNA基因序列特征相异的新菌群落研究密切相关。据已报道研究在与火山灰沉积物中微生物的生物矿化及参与地质元素化学循环中原核生物群落分布的种群代谢多样性[6-8]。另外，目前对于不同环境火山灰分离培养及参与风化的细菌多样性与环境因子的相关性关系研究发现：日本樱岛火山火山灰中分离培养获得的细菌菌群丰度与平均温度、pH 值、环境变量呈显著相关，而只与碳吸收保持统计学意义，而且温度越低，细菌丰度和土壤碳氮积累增加较慢[9]。

科洛火山群坐落于黑龙江省黑河市嫩江县小兴安岭西侧，作为地质生物演化、栖息繁衍的重点典型区域之一。小椅山火山属火山锥山体喷发于更新世晚期，火山锥周边遍及各种火山灰、火山浮渣、火山石、火山弹及熔岩台地等熔岩裸露，植被稀少，具备发育良好的微型火山地貌。小椅山火山环境生态条件恶劣，且保藏丰富的微生物资源，同时对地球物理化学循环推动作为贡献成员，对极地生态系统的构建和维持起到关键作用。因此，截至目前，国内对小椅山火山生境微生物栖息环境变化规律和地球化学循环作用机理尚不清楚，尤其对于适应于小椅山火山地质环境自然生态微生物多样性与火山环境内部有机质、碳、氮、磷及铁、硫等环境元素共同组成的相互关系尚无定论。研究为全面深入科洛火山群—小椅山火山灰中对地球化学循环、生物矿化、岩石风化等作用的地质微生物资源库提供科学基础数据。

1.1 主要试剂仪器

主要试剂：总铁测定试剂盒（广东环凯微生物科技有限公司，中国）；
细菌引物338F 和806R（上海英骏生物技术有限公司，中国）；
dNTP Mix（10 mM），Phusion HF MM（M0541L），Phusion（BioLabs，美国）；
VAHTSTMDNA Clean Beads（南京诺唯赞生物科技有限公司，中国）；
MinElute PCR Purification Kit（QIAGEN，德国）；
琼脂糖（BIOWEST，西班牙）；
去离子水（天根生化科技北京有限公司，中国）；
无水乙醇（500 mL）（北京化工厂，中国）。

主要仪器：pH 计（PHB-4 型，上海仪电科学仪器股份有限公司，中国），总有机碳（TOC）用HT1300 干法测定；
总有机碳碳氮元素分析仪（multi N/C 2100型，耶拿，德国）；
分光光度计（A003 型，上海菁华科技仪器有限公司，中国）；
Nanodrop（2000 型，赛默飞世尔科技有限公司，中国）；
PCR 仪（2720 型，Applied Biosystems，美国）；
微型离心机（1795 型，天根生化科技有限公司，中国）；
高通量测序仪（HiSeq2500，Illumina，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集

小椅山位于中国黑龙江省黑河市嫩江科洛断陷盆地中心区域（125°99′E，49°31′N），研究于2018 年10 月（秋季）对科洛火山群小椅山火山灰进行采样。在火山口顶部、中部、底部3 个位点分别采集0～5 cm深度范围内的火山灰，按照1∶1∶1 比例混合，得到小椅山火山灰混合样品，记为XYS1，XYS2，XYS3 三个样品重复，并迅速装入灭菌袋，低温运送至实验室，分别4 ℃和-20 ℃低温保存备用，一部分为后续理化分析，另一部分为高通量测序分析做准备。如图1 所示即小椅山火山灰采样区域概况图。

图1 小椅山火山灰采样区域概况图Fig.1 Overview of volcanic ash sampling area in Xiaoyishan

1.2.2 环境因子测定

实验以2.5∶1 水样比作为操作标准收集滤液上清液，火山灰样品pH 采用PHB-4 型带玻璃电极的数字pH 计测定。火山灰样品总有机碳（TOC）采用碳氮元素分析仪测定（multi N/C 2100 型，耶拿，德国），硝态氮（NO3-N）利用过硫酸钾消解—紫外分光光度法测定，总铁（TI）通过总铁试剂盒测定。

1.2.3 细菌多样性分析

采用MOBIO Power SoilRDNA 提取试剂盒（MOBIO Lab，CA，USA），提取小椅山火山灰样品总DNA，以一对通用的细菌引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）用来扩增细菌16S rRNA基因的V3+V4 可变区域；
采用20 μL 反应体系：ddH2O 13.25 μL，10xPCR Ex Taq Buffer 2.0 μL，DNA template（100 ng·mL-1）0.5 μL，primel（10 mmol·L-1）10 μL，prime2（10 mmol·L-1）1.0 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1）2.0 μL，Ex Taq DNA polymerase（5 U·mL-1）0.25 μL。PCR 扩增的条件为：95 ℃预变性5 min，然后95 ℃变性30 s、58 ℃退火20 s、72 ℃延伸6 s，共30 个循环，最后再72 ℃退火7 min，扩增产物保持在4 ℃条件下。合格的基因组样品在北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序。

建库测序：提取样品总DNA 后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库基于Illumina Novaseq 6000 测序平台得到的原始图像数据文件，经碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），结果以FASTQ（简称为fq）文件格式存储，其中包含测序序列（Reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。采用Trimmomatic v0.33 软件对原始测序序列进行质控，对低质量Raw reads 过滤，然后对小椅山火山灰三个重复样品测序共获得229 877 对Raw Reads 进行过滤质控；
使用cutadapt（v1.9.1）软件进行引物序列的识别与去除，采用FLASH（v1.2.7）软件和overlap 进行高质量Reads 拼接，均产生58643 条Clean Reads 拼接序列；
使用UCHIME v4.2 软件去除嵌合体，鉴定得到高质量序列（Effective Reads）；
最后进行聚类/去噪，划分OTUs/ASVs（后面统一称之为Feature），并根据Feature 的序列组成得到其物种分类。基于特征（Feature）分析结果，进一步对样品在各个分类水平上进行α 多样性分析（Alpha Diversity），β 多样性分析（Beta Diversity），显著物种差异分析，相关性分析，功能预测分析等等，可以挖掘样品之间的差异。

1.2.4 细菌多样性同环境因子的关系

运用CANOCO 5.0 软件（http：//canoco5.com/）对环境因子，微生物丰度变化和环境因子之间进行冗余分析（redundancy analysis，RDA），运用Pastv2.16软件（http：//folk.uio.no/ohammner/pastD）对群落与环境因子间的相关系数进行分析。RDA 模型的选择原则：先用species-sample 数据（97%相似性的样品OTU表）做PCA 分析，看分析结果中Lengths of gradient的第一轴的大小，如果在3.0～4.0 之间，选RDA 和CCA 均可，如果小于3.0，RDA 的结果要好于CCA。

2.1 小椅山火山灰环境因子

小椅山火山灰的pH，TOC，TI，NO3-N 环境因子的测定结果：pH 为7.31，呈中性，其TOC 含量为7.32%，NO3-N 含量为21.356 μg·g-1，TI 含量为1.875 mg·g-1。利用Canoco5.0 对species-sample 数据（97%相似性的样品OTU 表）做DCA 分析，得到的第一轴的大小为2，故选择RDA 模型。再利用Canoco5.0 对不同的环境因子进行RDA 分析（图2），筛选主要对小椅山火山灰有影响的环境因子，研究小椅山火山灰的不同环境因子之间的相关性。RDA 前两轴的累积贡献率为100%，其中第一主轴为96.84%（表1），已超过50%，包含大部分信息，故将其作为主分量轴，且主要是由第一主轴决定。从环境因子箭头与排序轴的夹角可以看出：火山灰中TOC、TI 和NO3-N 构成了RDA 的第一排序轴，TOC、TI 和NO3-N 与排序轴呈正相关；
pH 构成了第二排序轴。从环境因子之间的相关性来看，TI、NO3-N、TOC 相互之间均呈现正相关；
pH 与TI、NO3-N、TOC 呈现负相关。

表1 环境因子与小椅山火山灰细菌群落组成的相关系数分析Table 1 Correlation coefficient analysis between environmental factors and composition of bacterial communities in tephra of Xiaoyishan

表2 小椅山火山灰中细菌Alpha 多样性Table 2 The alpha diversity of bacteria in Xiaoyishan volcano tephra in the koluo-volcano region

图2 火山灰中不同环境因子之间的RDA 分析Fig.2 RDA analysis of different environmental factors in tephra

2.2 小椅山火山灰细菌多样性分析

2.2.1 Alpha 多样性指数

通过Alpha 多样性分析可以反映样品内的微生物群落的丰富度和多样性。常用的度量指数主要包括Chao1 指数体现群落丰富度，以及Shannon 指数和Simpson 指数均体现群落均匀度情况。小椅山火山灰细菌多样性测序共获得61 338 条序列，这些序列根据97%的相似性标准可划分为2 182 个操作分类单位（OTU），小椅山火山灰细菌的Shannon 指数为9.202 9，Simpson 指数为0.989 4，Chao l 指数为2 182。其中Shannon 指数越高，表明群落多样性越高；
Chao 1 指数越大，表明群落的丰富度越高。图3 为小椅山火山灰细菌16S rRNA 基因高通量测序稀释曲线图，从图3 可看出，曲线逐渐趋于平缓，其测序程度已经覆盖到小椅山火山灰样品的所有物种，可以基本反映样品测序的真实情况。

图3 小椅山火山灰细菌的16S rRNA 基因高通量测序稀释曲线Fig.3 The dilution curve of 16s rRNA gene of bacteria form Xiaoyishan volcanic ash based on high throughput sequencing

2.2.2 小椅山火山灰细菌组成

小椅山火山灰中细菌的群落组成和优势群落如图4 反映了门水平和属水平上的系统发育分类学和统计学分析。结果表明，小椅山火山灰细菌共获得53 003 条序列，999 个OTU 分布，其中在门水平上，涵盖了Proteobacteria（25.151%），Actinobacteria（22.042%），Firmicutes（17.088%），Bacteroidetes（8.369%），Acidobacteria（7.054%），Gemmatimmonadetes（5.173%），Others（5.065%），Chloroflesi（3.509%），Verrucomicrobia（3.383%），Patescibacteria（1.998%）等32 个菌门。在属水平上，Lactobacillus（8.394%）属于厚壁菌门，Gemmatimonas（2.287%）属于芽单胞菌门，其他细菌类群Others（72.112%），Uncultured bacterium 未鉴定的细菌（17.207%）可能是新的细菌类群，它们的分类 地位未能确定，待继续进一步研究。

图4 小椅山火山灰中细菌在门和属水平上的群落组成（a：门水平；
b：属水平）Fig.4 The community composition of bacteria in the tephra of Xiaoyishan（a：phylum level，b：genus level）

2.3 小椅山火山灰细菌多样性同环境因子的关系

小椅山火山灰细菌多样性同环境因子的关系经由RDA 分析结果如图5 所示。由图可知，从射线长度方面，4 个影响因子的射线长度相差较小。从射线与射线的夹角大小方面：Actinobacteria 与TOC、NO3-N 和TI 的夹角最小，即TOC、NO3-N 和TI 对Actinobacteria 的影响显著；
Acidobacteria、Proteobacteria及Gemmatimmonadetes 与TOC、NO3-N 和TI 的夹角相对较小，即TOC、NO3-N 和TI 对Acidobacteria、Proteobacteria 及Gemmatimmonadetes 的影响显著。Bacteroidetes 与pH 的夹角相对偏小，即pH 对Bacteroidetes 的影响显著。综上，小椅山火山灰中不同菌属对环境因子的响应存在着较大差异。

图5 火山灰细菌多样性同环境因子的RDA 分析Fig.5 RDA analysis of bacterial diversity in tephra with environmental factors

科洛火山位于大兴安岭山地与松嫩平原的过渡地带，五大连池火山群以北，属小兴安岭西段余脉，火山面积约350 平方公里。其中小椅山火山地理位置特殊，作为科洛火山群中保存完整火山锥并有火山口。火山锥附近有火山灰、火山浮石、火山弹和熔岩台地，其东南60 公里为五大连池火山群，地处东北寒区地带，这导致火山环境极端特殊，通过对理化因子的测定结果发现该火山灰中大部分环境因子参数TOC、NO3-N、TI 作为优势菌门，Proteobacteria 变形菌门（25.151%），Actinobacteria 放线菌门（22.042%），Firmicutes 厚壁菌门（17.088%），Acidobacteria 酸杆菌门（7.054%）的生长提供充足的能量来源，这与实验室前期对科洛火山小孤山细菌与TOC、NO3-N 环境因子相关性结果相类似[7]。小椅山火山属溢流式喷发自中—晚更新世以来，区内火山活动逐渐活跃，该时期的火山活动仍受NE 向基底断裂控制，而且火山均由碱玄质火山渣锥和熔岩流组成，山体结构完整，小椅山火山锥的主体是由红色火山渣与黑色火山渣构成，其黑红色火山渣主体界线颜色差异反映出火山环境铁离子的不同氧化价态，以此说明此火山TI 环境因子影响显著[8]。总碳、铵态氮环境因子相关性影响显著以及pH 中性，不过，也受一些人为因素影响如旅游、人工种植、人为取石开采等的影响；
自然界中铁循环与碳氮循环有着紧密联系，部分碳氮铁循环过程中还存在着偶合反应，这与在RDA 分析中，NO3-N、TOC 与TI 互为正相关的结果相对应[6]。

目前研究对科洛火山环境样品是通过结合高通量测序的方法进行研究，可知火山灰细菌主要分布在变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、酸杆菌门Acidobacteria、芽单胞菌门Gemmatimonadetes、疣微菌门Verrucomicrobia、绿弯菌门Chloroflexi 等。基于属水平分析，Lactobacillus是小椅山火山灰细菌的优势菌群，通常存在含盐碱地根际土壤生境中生存。小椅山火山灰细菌还包括Gemmatimonas，它们属于芽单胞菌门，芽孢杆菌科，被认为主要是好氧或兼性厌氧的异养菌，对可利用的TOC 有较快的应激。另外，火山灰环境中的微生物在氮素循环不同环节中的作用能够利用铵态氮经微生物活动如：硝化细菌的硝化作用将其生物氧化转变成为硝态氮供给自身营养补充；
而且许多来源于变形杆菌门的生丝微菌科多为低碳和化学异养菌，这些生物能够利用硝态氮作为氮源与低能度碳源情况下才能正常生长，其不能在营养丰富的培养基中生长。其中，在门水平上火山灰优势细菌群落与土壤化学性质的RDA 相关性结果（图5）：绝大多数优势菌门都与土壤化学因子有特定的相关性关系。Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）与土壤pH 呈显著正相关关系，Proteobacteria（变形菌门）与土壤全氮呈显著正相关关系。故此结果与研究学者[10-16]对土壤细菌群落的环境因子相关性影响结果类似。因此Proteobacteria 与TOC 呈显著正相关关系；
Bacteroidetes 与土壤全氮呈显著正相关关系，以此说明土壤全氮可能是影响Proteobacteria 和Bactemidetes 丰度的重要影响因子，这与贵州黄壤中细菌群落组成与环境因子的显著性关系结果相类似[17]。火山灰喷发时代年龄差异不仅是微生物群落组成的主要因素也与其他因素，如空间异质性、有机碳含量、外源降雨和风等气候外界因素共同影响微生物多样性和群落分布动态。

小椅山火山灰样品微生物多样性与外部环境因子RDA 分析（图5），分析结果表明火山灰中不同菌属对环境因子的响应也存在着较大差异，其中TOC、NO3-N、TI 与大多数菌属均呈正相关，为研究小椅山火山灰细菌群落多样性重要环境因素影响，这可以解释为硝态氮在环境因子里是具有代表性的元素之一，为优势菌门生长提供能量来源，所以是影响火山灰细菌多样性的重要环境因素。另外除去环境的外部因素，还有其他微生物之间的相互作用的内部因素[17-20]，同样也是影响微生物群落结构的重要因素。比如，好氧微生物[21]的生命活动对氧气的消耗造成局部的厌氧环境，有利于环境中铵态氮的转化至硝态氮营养积累供给微生物所需；
微生物对有机物的硝化作用等十分重要。

通过高通量测序分析小椅山火山灰微生物多样性，以及结合小椅山火山灰环境因子测定结果，最终得出：小椅山火山灰样品的pH 为7.31，呈中性；
TI 含量为1.875 mg·g-1，TOC 含量为7.32%，TN 含量为4.75 μg·g-1，硝态氮（NO3-N）含量为21.356 μg·g-1；
火山灰环境共获得2 182 个OTU 分布，在门水平上，主要优势菌门变形菌门（Proteobacteria，25.151%），放线菌门（Actinobacteria，22.042%），厚壁菌门（Firmicutes，17.088%），拟杆菌门（Bacteroidetes，8.369%），酸杆菌门（Acidobacteria，7.054%），芽单胞菌门（Gemmatimmonadetes，5.173%）等32 个细菌门类。在属水平上，其主要优势菌群为Lactobacillus（8.394%）和Gemmatimonas（2.287%），这些优势菌群主要由厚壁菌门和芽单胞菌门组成；
通过小椅山火山灰微生物多样性同环境因子的关系的RDA 图可知，TOC、NO3-N、TI 与小椅山火山灰大多数功能优势菌属呈正相关，故推测TOC、NO3-N、TI 是影响小椅山火山灰微生物多样性的重要环境因素。因此，研究火山生境火山灰环境微生物多样性及地质化学循环，对于参与地球生命活动的地质微生物群落多样性同与环境因子相关性研究具有重要的指示意义。

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