MICAL2、miR-340-5p在胃癌组织中的表达及其临床意义

段战锋,张巍巍,申晓燕

(河南省许昌市中心医院鹿鸣湖院区1.肿瘤内科二病区,2.胃肠外科,河南 许昌 461000)

胃癌是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一[1]。它是全球癌症相关死亡的第二大原因,虽然目前针对胃癌的临床治疗有多种选择,但术后复发和转移是胃癌治疗的最大障碍[2],且患者的预后很差,尤其是在肿瘤晚期[3]。胃癌患者的5年总生存率仅约30%[3]。这主要是由于对癌症异质性的了解较少,以及缺乏理想的生物标志物用于早期检测。因此,确定胃癌的分子特征,寻找新的诊断和治疗靶点是当前研究的重点。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种小型非编码RNA,可以调节RNA转录,进一步促进或抑制肿瘤基因表达。到目前为止,数据库中已经鉴定和报道了一千多个人类miRNA[4],其中一些已经被用作诊断、预后和治疗的分子生物标志物。miR-340-5p是一种研究较少的miRNA,但已有证据表明其在包括癌症在内的许多疾病中发挥重要作用[5-7]。MICAL2(Molecule interacting with Cacl 2)是MICALs家族的一个特殊成员,已被确定为多种癌症的肿瘤促进剂,包括前列腺癌、胃癌、乳腺癌和结肠直肠癌,参与细胞迁移、侵袭、变形和增殖[8]。尚不清楚miR-340-5p是否通过靶向MICAL2参与胃癌的发生。因此,本研究通过检测胃癌组织中MICAL2、miR-340-5p的表达,探讨二者在胃癌组织中的作用及关系,现报道如下。

1.1 研究对象

选取2017年1月至2018年6月本院收治的胃癌患者为研究对象,收集96例手术患者的胃癌组织及离肿瘤边缘5 cm处的癌旁组织。离体组织迅速置于液氮中冷冻,之后转移到-80 ℃保存至使用,且所有标本均经组织病理学证实。患者中男66例,女30例。

根据肿瘤-淋巴结转移(TNM)分期系统对肿瘤进行分期,Ⅰ期和Ⅱ期共35例,Ⅲ期和Ⅳ期共61例。组织学分级按照国家综合癌症网络(NCCN)肿瘤学临床实践指南进行评估。纳入标准:(1) 首次确诊,未采用其他治疗方案治疗;(2) 通过影像学检查、病理检查确诊为胃癌患者。排除标准:(1) 合并其他恶性肿瘤者;(2) 造影剂过敏者;(3) 有慢性胃炎、胃出血、胃穿孔等胃部疾病者;(4) 临床资料不完整者。本研究经我院道德伦理委员会批准通过,所有样品采集均取得受试者知情同意,符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测组织中miR-340-5p水平 使用TRIzol试剂(Ambion,USA)从组织样品中提取总RNA,取1 μg总RNA作为模板,采用反转录试剂盒进行反转录,获得cDNA。采用GoTaq qPCR Master Mix(Promega)在Mx3005P Real-time PCR系统(Stratagene,USA)上进行qRT-PCR。反应条件为:95 ℃ 10 min预变性,95 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;共循环45次。以U6作内参基因,采用2-ΔΔCT法对组织miR-340-5p表达水平进行定量分析。miR-340-5p及内参引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.2 免疫组织化学染色观察组织中MICAL2蛋白表达情况 免疫组化分析采用EnVision两步法进行。操作按照实验室程序和试剂盒说明书进行。将保存的胃癌以及癌旁组织标本进行石蜡切片,常规脱蜡、水合,3%双氧水作用8 mim去除内源性酶活性,柠檬酸修复抗原,PBS冲洗3次,每次3 min,除去PBS后加入一抗(MICAL2兔多克隆抗体)4 ℃孵育过夜。PBS冲洗后加入二抗37 ℃孵育20 min,DAB染色,苏木精复染。脱水、透明后封片,PBS代替一抗作为阴性对照。

对染色结果进行病理图像分析,于光学显微镜下观察,根据显色强度和阳性细胞百分率综合计分。细胞膜和细胞质中未观察到棕黄色颗粒状沉淀为0分,细胞膜及细胞质呈淡黄色颗粒状沉淀为1分,细胞膜和细胞质呈现浅棕色颗粒状沉淀为2分,细胞膜和细胞质呈现棕黄色颗粒状沉淀为3分;阳性细胞百分率<10%为1分,阳性细胞百分率10%～50%为2分,阳性细胞百分率>50%为3分。综合计分为以上两种评分相加,≤3分为低表达,>3分为高表达。

1.2.3 Western-blot法检测MICAL2蛋白表达水平 将组织样品置于含有蛋白裂解剂的冰中孵育30 min,然后在4 ℃下离心30 min,利用二辛可宁酸(BCA)进行蛋白质定量。取50 μg总蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封闭2 h后,将膜与MICAL2一抗[货号:ab241260,艾博抗(上海)贸易有限公司]和GAPDH[货号:ab8245,艾博抗(上海)贸易有限公司]在4 ℃下孵育过夜。然后用TBS-Tween-20(TBST)洗涤膜,并与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗[货号:ab9482,艾博抗(上海)贸易有限公司]在室温下放置60 min。用TBST洗涤后,使用增强型化学发光系统(EMD Millipore)对膜进行显影。使用ImageJ 2.1软件对蛋白表达水平进行定量。

1.3 随访

所有患者自术后开始门诊或者电话定期随访,观察患者的生存时间和生存率,随访截止时间为2021年6月,终点事件为患者死亡。

1.4 统计学处理

2.1 胃癌组织与癌旁组织中miR-340-5p表达水平的比较

胃癌组织中miR-340-5p表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 胃癌组织与癌旁组织中miR-340-5p表达水平的比较Tab 2 Comparison of miR-340-5p levels in gastric cancer tissues and adjacent

2.2 胃癌组织和癌旁组织中MICAL2蛋白的表达情况

胃癌组织中MICAL2蛋白阳性表达率为71.88%(69/96),癌旁组织中MICAL2蛋白阳性表达率为11.46%(11/96),差异有统计学意义(χ2=72.086,P<0.001)。胃癌患者组织中MICAL2蛋白的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05),见图1、表3。

图1 MICAL2蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达Fig 1 Expression of MICAL2 protein in gastric cancer and adjacent tissues

表3 胃癌组织与癌旁组织中MICAL2蛋白表达水平的比较Tab 3 Comparison of MICAL2 protein expression levels in gastric cancer tissues and adjacent

2.3 胃癌患者中MICAL2、miR-340-5p表达的相关性

Pearson法分析结果显示,胃癌患者组织中MICAL2表达与miR-340-5p表达呈正相关,差异有统计学意义(r=0.313,P<0.05)。见图2。

图2 胃癌患者中MICAL2表达与miR-340-5p表达的相关性Fig 2 Correlation between MICAL2 and miR-340-5p expression in patients with gastric cancer

2.4 MICAL2蛋白和miR-340-5p表达与胃癌患者临床病理参数的关系

胃癌组织中MICAL2蛋白和miR-340-5p表达与年龄、性别、分化程度、浸润程度、肿瘤大小无关(P>0.05),与淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05)。见表4。

表4 胃癌组织中MICAL2蛋白、miR-340-5p的表达与临床病理参数的关系Tab 4 Relationship between the expression of MICAL2 protein, miR-340-5p and clinicopathological parameters in gastric cancer tissues

2.5 Kaplan-Meier生存分析

96例患者均完成3年随访,末次随访日期2021年6月30日,共32例死亡,64例存活。以miR-340-5p、MICAL2相对表达量均值为基准,超出该范围判定为高表达,低于该范围定义为低表达。绘制3年生存曲线,Kaplan-Meier分析结果显示,miR-340-5p高表达组患者3年累积生存率(80.00%)显著低于低表达组(52.17%)(Log rankχ2=9.096,P=0.003),MICAL2蛋白高表达组患者3年累积生存率(72.46%)显著低于低表达组(51.85%)(Log rankχ2=4.329,P=0.037),见图3。

图3 不同MICAL2、miR-340-5p表达患者Kaplan-Meier生存曲线Fig 3 Kaplan-Meier survival curve of patients with different MICAL2 and miR-340-5p expressions

2.6 影响胃癌患者预后的Cox回归分析

以是否死亡为因变量,miR-340-5p、MICAL2、淋巴结转移、TNM分期为自变量进行Cox回归分析,结果显示MICAL2、miR-340-5p、淋巴结转移、TNM分期均是影响患者预后的危险因素(P<0.05),见表5。

表5 影响胃癌患者预后的Cox回归分析Tab 5 Cox regression analysis of influence on prognosis of patients with gastric cancer

胃癌早期症状与一般胃病相似,是一种发病隐匿的恶性肿瘤,被发现时通常已处于肿瘤晚期[9]。目前,我国每年新增多达40万胃癌病例,其发病率仅次于肺癌,死亡率仅次于肺癌和肝癌,已成为威胁民众健康的重大疾病之一[10-13]。因此,早发现、早诊断、早治疗是提高疗效和生存率的关键。

miRNA是由20～24个核苷酸组成的非编码小RNA分子,主要参与各种细胞活动的转录调控[14]。然而,miRNA的异常改变与多种生物学过程有关,包括肿瘤形成、血管生成和脂质代谢的改变。它们通常通过靶向癌基因、肿瘤抑制基因、转录因子以及其他涉及细胞死亡和生存的调控因子来调节肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药性[15]。miR-340被报道为乳腺癌的抑制性miRNA[16]。对结直肠癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胃癌的研究证实,miR-340在癌细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥抑制作用[17-18]。Xiao等[19]研究发现,miR-340-5p在胃癌组织中表达显著上调,表明miR-340可能在胃癌中发挥促癌作用。本研究发现,胃癌组织中miR-340-5p表达水平显著高于癌旁组织,胃癌组织中miR-340-5p表达与年龄、性别、分化程度、浸润程度、肿瘤大小无关,与淋巴结转移、TNM分期有关,提示miR-340-5p可能参与胃癌的发展进程,推测miR-340-5p水平的升高可能通过促进淋巴结转移累及其它器官或系统,促使癌症恶化。本研究Kaplan-Meier分析显示,miR-340-5p高表达组患者3年累积生存率显著低于低表达组,提示miR-340-5p表达水平还可影响预后。

MICAL2是MICALs家族的成员之一,MICALs是一个进化保守家族,涉及细胞生长、轴突引导、囊泡运输和细胞凋亡,参与细胞骨架动力学和相关基本生物过程的调控[20]。Zhou等[8]研究发现,MICAL2可促进肺腺癌的侵袭和生长。另有研究[21]发现,MICAL2在内皮细胞中的表达参与炎症诱导的新血管生成,而诱导血管生成能力是公认的癌细胞特性。本研究通过免疫组织化学染色发现,胃癌组织中MICAL2蛋白阳性表达率为71.88%,显著高于癌旁组织中的11.46%(11/96);进一步通过Western blot定量分析发现,胃癌组织中MICAL2蛋白表达水平显著高于癌旁组织,胃癌组织中MICAL2蛋白表达与患者年龄、性别、分化程度、浸润程度、肿瘤大小无关,与淋巴结转移、TNM分期有关,提示MICAL2蛋白也与胃癌的恶性程度相关,可能通过影响炎症诱导的新血管生成促进癌症进展。Kaplan-Meier分析结果显示,MICAL2蛋白高表达组患者3年累积生存率显著低于低表达组,提示MICAL2蛋白表达水平可影响患者3年累积生存率。本研究进一步使用Pearson相关分析发现,胃癌组织中MICAL2与miR-340-5p表达水平呈正相关,提示二者在胃癌中可能存在正调控机制共同参与胃癌的发生发展并影响患者的预后。Cox回归分析结果显示,MICAL2和miR-340-5p高表达、淋巴结转移、TNM分期均是影响患者预后的危险因素,提示对于MICAL2、miR-340-5p高表达的患者,应该在术后给予更严密的随访观察,必要时给予辅助治疗,以期改善预后。

综上所述,MICAL2和miR-340-5p在胃癌组织中均呈现高表达,二者与胃癌病情发展和预后密切相关,有望成为新的胃癌靶标,为开发新的诊治方法及判断预后提供参考依据。但目前二者在胃癌发展中的确切机制尚不明确,需在今后进行更深入的研究。

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