发酵法提取覆盆子黄酮的研究

蒋晓蕊 许 岩 李 婷 曹宝帅 张李莉 范桂强 孙金旭

（1 衡水市质量与标准化研究院 河北 衡水 053000；
2 衡水市综合检验检测中心 河北 衡水 053000；

3 衡水学院 河北 衡水 053000）

覆盆子为蔷薇科悬钩子属植物，2015 年国家卫计委把覆盆子列为药食同源食品。药用覆盆子为覆盆子未成熟果实，经采摘热烫后，干燥而成。覆盆子具有多种功能性成分，如黄酮类化合物、多酚类物质、鞣花酸、生物碱、有机酸、甾醇等[1，2]。研究证明，覆盆子入膀胱经，覆盆子提取物和活性成分具有抗氧化、防癌抗癌、抗老化、温肾补肾、预防心脑血管疾病等功效[3～5]。黄酮类化合物为覆盆子中的主要功能成分，具有重要的作用。药物中提取黄酮的方法很多，发酵法提取功能成分，微生物在发酵生长过程中会产生很多种酶如纤维素酶、蛋白酶等，这些酶对植物细胞破壁起到关键性作用，有利于提高提取率。本研究旨在以覆盆子为原料，利用发酵法提取覆盆子中的黄酮类物质，为工业提取提供支持，有利于覆盆子黄酮的药物应用。

1.1 材料。覆盆子(北京同仁堂衡水分店)经清洗后，烘干，粉碎机粉碎后过80 目筛；
芦丁标准品(购于国家标准物质网)，菌种(衡水学院生命科学系菌种室保藏)。

1.2 仪器设备。破壁机(深圳市净品环保科技有限公司)；
电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；
分光光度计(722G 可见分光光度计广州广一科学仪器有限公司)；
发酵桶8 L(特百惠食品级)。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制。准确的称取芦丁标准品10 mg，用60%的乙醇溶解后转入100 ml 的容量瓶中定容，摇匀，得到100 mg/L 的芦丁标准品溶液。

1.3.2 绘制标准曲线。用移液枪准确的量取芦丁标准液0、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，加入到比色管中，依次添加浓度为5%的NaNO21 ml，摇匀后，静置10 min，添加10%的硝酸铝1 ml，摇匀后静置10 min，添加10%的氢氧化钠溶液10 ml，摇匀后用60%的乙醇溶液添加至刻度线，摇匀后，510 nm 测定吸光度值。以测定的吸光度值为纵坐标，芦丁的浓度为横坐标，绘制标准曲线，分析得到回归方程：A=0.0137C-0.052，R2=0.997。

1.3.3 覆盆子黄酮测定。取经发酵提取过滤后的覆盆子黄酮提取液20 ml，用浓度为60%的乙醇溶液稀释至50 ml 后，按芦丁标准液处理方法处理后测定吸光度值。

2.1 菌种对发酵法提取覆盆子黄酮的影响。菌种不同，代谢途径不同，产生的酶不同，对粉碎后的覆盆子细胞壁破坏程度不同，提取效果也不同。根据参考文献资料报道，分别选取枯草芽孢杆菌、黑曲霉、安琪酵母、木醋杆菌、乳酸菌作为发酵菌，普通提取作为对照，研究菌种对发酵法提取覆盆子黄酮的影响，结果如图1 所示。由图1 分析可知，发酵法提取较普通提取，虽然使用的菌种不同，但都能提高覆盆子黄酮的提取率，菌种不同产生的酶系不同，破壁提取的效果不同。相比之下，使用安琪酵母作为菌种，覆盆子黄酮的提取量达到29.65 mg/g，相对普通水提，提取率提高最大，其它虽然也有提高，但提取率增加不大，因此，安琪酵母作为发酵提取菌种较为适宜。

图1 菌种对发酵提取的影响

2.2 料液比例对发酵法提取覆盆子黄酮的影响研究。根据报道，料液比例对提取活性成分也会产生很大的影响，适宜的料液比例会有利于破壁提取，分别设定料液比例为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，经处理后，安琪酵母按照1.0%的接种量接种，培养发酵时间为24 h，发酵培养结束后，过滤杀菌后测定黄酮含量，结果如图2 所示。由图2 可知，料液比例对发酵法提取覆盆子黄酮影响较大，随着料液比例的增大(溶液浓度的降低)，覆盆子黄酮提取量逐渐增加，当料液比例为1∶20时，发酵法提取覆盆子黄酮的提取量最大，之后随料液比例的增加，覆盆子黄酮提取量有所降低，表明料液比例1∶20 较为适宜，具体原因有待于进一步分析。

图2 料液比例对发酵提取的影响

2.3 接种量对发酵法提取覆盆子黄酮的影响。处理后的覆盆子，按照1∶20 的料液比例，经煮沸灭菌，降温后按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的接种量接种安琪酵母，经发酵培养24 h 后测定覆盆子黄酮提取量，结果如图3 所示。接种量不同，也就是发酵初始的发酵液中菌种数量不同，覆盆子黄酮提取量不同。低接种量，菌量增加较慢，高接种量，菌之间会产生竞争抑制，所以需要寻找适宜的接种量。经测定分析，安琪酵母接种量为2%时，覆盆子黄酮提取量最高，确定2%为安琪酵母适宜接种量。

图3 接种量对发酵提取的影响

2.4 发酵时间对发酵法黄酮提取量的影响。经处理后的覆盆子，按1∶20 的料液比例，经煮沸灭菌，自然降温至28 ℃，安琪酵母接种量2%，发酵液每8 h 取样测定1 次，结果如图4 所示。发酵时间不同，菌种的代谢产物差别较大，随着发酵时间的延长，覆盆子黄酮提取量逐渐增加，当发酵时间为36 h 时，覆盆子黄酮提取量最大，因此确定发酵时间以36 h 较为适宜。

图4 发酵时间对发酵提取的影响

2.5 普通提取与发酵提取覆盆子黄酮对比分析。优化后的发酵法提取覆盆子黄酮与普通热浸提覆盆子黄酮对比分析如图5 所示。对比分析可知，优化后发酵法提取覆盆子黄酮提取量达到42.36 mg/g，普通热水浸提覆盆子黄酮提取量为17.30 mg/g，优化后的发酵法提取覆盆子黄酮相对普通提取提高144.86%，表明发酵法提取覆盆子黄酮是非常行之有效的提取方法。

图5 发酵法与普通法对比分析

利用发酵法和普通法对比提取覆盆子黄酮，对发酵法提取从菌种选择、料液比例、接种量、发酵时间进行优化研究，优化后的发酵法提取覆盆子黄酮提取工艺为：菌种选择安琪酵母，料液比例1∶20，接种量2%，发酵时间36 h，此条件下覆盆子黄酮提取量为42.36 mg/g，相对于普通热浸提提高144.86%，菌在发酵生长过程中能产生大量多种多样的酶，这些酶对植物细胞壁破壁作用效果明显。表明发酵法提取覆盆子黄酮是行之有效的提取方法。

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