FATP1对山羊肌内脂肪细胞的促进作用

李琪，杨昌恒，王永，林亚秋,，向华，朱江江,

对山羊肌内脂肪细胞的促进作用

李琪1，杨昌恒1，王永1，林亚秋1,2，向华2，朱江江1,2

1青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室/西南民族大学，成都 610041；
2青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室/西南民族大学，成都 610041

【背景】脂肪酸转运蛋白1（FATP1）能够促进哺乳动物脂肪酸摄取，该过程对维持机体脂代谢平衡十分重要，也对家畜的肉质好坏有着重要影响。【目的】通过获得山羊的CDS区序列，检测该基因在山羊不同组织中的表达量，探究其对山羊肌内脂肪细胞脂质代谢的影响，为进一步揭示在山羊脂代谢中的作用机制提供参考，为山羊的遗传育种改良提供理论依据。【方法】利用RT-PCR方法克隆获得山羊的CDS区序列，利用在线工具分析其亲疏水性、跨膜区域、信号肽等生物学特性，并构建其氨基酸序列系统进化树。利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测在山羊不同组织中的表达水平，构建其组织表达谱。利用构建的真核表达载体和筛选出的siRNA对山羊肌内脂肪细胞进行FATP1过表达和干扰处理，通过油红O染色和甘油三酯测定检测过表达和干扰后对山羊肌内脂肪细胞脂质沉积的影响，并通过RT-qPCR技术进一步探究该基因过表达和干扰后对脂质代谢相关基因表达的影响。【结果】克隆获得了CDS区1 941bp，共编码646个氨基酸残基，预测其分子式为C3196H5026N884O898S25，推测该蛋白为碱性疏水稳定蛋白。三级结构预测显示，山羊与绵羊的FATP1蛋白质三级结构相似，而与牛的FATP1蛋白质三级结构略有不同。氨基酸序列系统进化树分析显示，山羊FATP1与绵羊亲缘关系最近。RT-qPCR检测发现在山羊小肠中表达量最高。油红O染色及甘油三酯测定表明过表达FATP1后山羊肌内脂肪细胞内脂滴数量增多，脂质含量增加，而干扰FATP1后则得到了相反的结果。进一步检测脂质代谢相关基因的表达变化，发现在山羊脂肪细胞中过表达后，脂肪酸合成、转运等相关基因（＜0.01）、（＜0.01）、（＜0.01）、（＜0.01）、（＜0.01）、（＜0.01）及（＜0.05）的表达水平显著升高，而脂解相关基因（＜0.01）的表达水平则显著降低；
干扰后，脂肪酸转运、延长等相关基因（＜0.01）（＜0.01）和（＜0.05）的表达量显著下降，脂解相关基因（＜0.01）和（＜0.05）的表达量显著上升。【结论】FATP1可能通过促进细胞脂质生成相关基因的表达，降低脂质降解相关基因的表达，从而显著促进山羊肌内脂肪细胞脂质的沉积，这些结果为进一步揭示在调控脂质代谢中的作用及分子机制提供了试验参考。

山羊；
脂肪酸转运蛋白1；
肌内脂肪细胞；
脂质沉积

【研究意义】哺乳动物体内的脂质积累已经被广泛研究了几十年，它与人类的肥胖和家畜的肉类品质有着重要的联系[1-3]。尤其是肌内脂肪的含量对肉质影响极为重要，会直接影响肉色、嫩度、风味[4]等方面。而脂肪细胞是机体脂质储存的主要部位[5]，细胞对脂肪酸的摄取主要是由蛋白质介导的，有几个蛋白质家族参与了这一过程，其中一个家族是脂肪酸转运蛋白家族（fatty acid transport proteins, FATPs）。FATPs是一类参与脂肪酸吸收和活化的重要蛋白质，目前在哺乳动物基因组中共发现了6个成员，FATP1—6[6-7]。这6种已经鉴定的FATPs的表达具有组织特异性[8]，在维持机体的脂肪酸（FAs）稳态中发挥重要作用。简州大耳羊是我国培育的第二个肉用山羊品种，影响羊肉品质的因素较多，如遗传因素，营养因素，饲养环境等，而基因调控是肉质调控的重要方式，有关脂质代谢的相关基因的克隆、功能分析、生物学特性方面的研究可以提升羊肉品质，为山羊遗传特性的改良提供理论依据。【前人研究进展】FATP1是第一个被鉴定的该家族成员，在脂肪细胞中最具特征[9]。FATP1也称为溶质载体家族27成员1（SLC27A1），由Schaffer和Lodish[10]从3T3-L1脂肪细胞cDNA表达文库中鉴定和克隆。FATP1是一种进化上保守的膜蛋白[11]，在蛋白质的氨基末端区域有一个跨膜结构域[12]，该蛋白质主要定位于细胞质膜[10]和内质网[13]，对动物的脂肪沉积具有调控作用[14-15]。哺乳动物FATP1最初被确定为一种脂肪酸转运体[11]。然而，随后研究发现FATP1具有酰基辅酶A合成酶活性[16-18]，与超长链辅酶A合成酶家族具有广泛的氨基酸相似性[16]，其表达与脂肪酸摄取之间存在良好的相关性[19-20]，能够促进哺乳动物脂肪酸摄取[21-23]。研究表明。过表达FATP1可以增加脂肪细胞的FAs输入，促进三酰甘油的合成[21,24-25]，而脂肪酸氧化则会受到干扰，略有减少[26]，而FATP1表达的降低能够显著降低小鼠脂肪组织中FAs的摄取量[27]。【本研究切入点】尽管FATP1与脂肪酸代谢有关的研究越来越多，但关于FATP1调控山羊脂肪细胞内脂质代谢的研究还未见报道。本试验利用RT-PCR方法克隆获得山羊，利用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）检测该基因在山羊不同组织中的表达量，利用油红O染色观察干扰或过表达FATP1对山羊脂肪细胞脂质代谢的影响，并利用RT-qPCR检测脂质代谢相关基因的表达变化。【拟解决的关键问题】这些结果将为进一步研究FATP1调控山羊肌内脂肪细胞脂质代谢机制提供重要的数据支持，为山羊遗传特性的改良提供基础理论。

所有试验均于2020年9月至2021年10月在西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室完成。

1.1 试验材料

1.1.1 试验取材 随机选取6只成年（1周岁）健康的雄性简州大耳羊为试验动物（购自四川省简阳市大哥大牧业有限公司）。屠宰后采集其心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、瘤胃等组织样品，将采集的各组织分割成黄豆大小，用DEPC水清洗干净后迅速装入无RNase的冻存管中，置于液氮中保存，用于后续组织RNA的提取。

1.1.2 试验试剂 DNA回收试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司，DNA聚合酶、TRIzol、pMD-19T Vector、限制性内切酶购自宝（TaKaRa）生物公司，SYBR qPCR Master Mix试剂盒、反转录试剂盒购自南京诺维赞公司。DMEM/F-12培养基、Opti-MEM、PBS缓冲液 pH7.4购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司；
BCA 总蛋白质定量试剂盒，胰蛋白酶，青霉素-链霉素购自武汉博士德（Boster）生物工程有限公司；
细胞/组织甘油三酯提取试剂盒购自北京普利莱（Applygen）基因技术有限公司；
其他实验室常规药品及试剂均为国产。

1.2 试验方法

1.2.1 组织总RNA提取及反转录 用Trizol法提取简州大耳羊的心、肝、脾、肺、肾、瘤胃等组织的总RNA，测定总RNA的OD260/OD280值，当该值在 1. 8—2. 0 之间说明可正常使用，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。利用反转录试剂盒将提取的RNA反转录合成cDNA，反应体系及条件：总RNA 1 μg，4×gDNA wiper Mix 4 μL，加 RNase-free ddH2O水至16 μL，42℃ 2 min；
然后加入5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix 4 μL，37℃ 15 min，85℃ 5 s。-20℃保存。

1.2.2 山羊克隆 根据GenBank上山羊的（XM_018051382.1）预测序列，利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物（表1）。RT-PCR反应总体系：LA Taq 0.2 μL，dNTP Mix 3.2 μL，10×Buffer 2 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1μL，模板cDNA 1μL，加水补至20 μL。利用Touchdown PCR方法进行克隆，Touchdown PCR扩增程序：94℃预变性3 min；
94℃变性15 s，64℃/66 ℃退火30 s，72℃延伸2 min，每个循环降低0.5℃，20个循环；
94℃变性15 s，55℃/56℃退火30 s，72℃延伸2 min，15个循环；
72℃延伸10 min，4 ℃保存。1%的琼脂糖凝胶检测PCR产物后利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收纯化，将回收产物连接到pMD-19T载体上，通过热激转化到感受态细胞（DH5α）中，然后接种于涂有IPTG和X-gal的LB固体培养基（含Amp）上，37℃过夜培养后挑取白色阳性菌落，进行菌液PCR鉴定后送至成都擎科生物技术有限公司进行测序。

表1 FATP1的CDS区克隆引物

1.2.3 山羊生物学特性分析 使用Bioxm 2.6软件对测序获得的序列进行开放阅读框预测，并将其翻译为氨基酸序列；
使用ProtParam在线工具对翻译后所得FATP1蛋白序列进行分子量、等电点、酸碱性等理化性质分析；
使用Prot Scale（http://web.expasy.org/protscale）预测蛋白亲疏水性；
利用ExPASy（https://embnet.vital-it.ch/software/ TMPRED_form.html）预测蛋白跨膜区域；
利用EMBL-EBI（https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/）及TargetP-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP- 2.0/）进行蛋白信号肽的预测。使用SOPMA分析该蛋白的二级结构，通过SWISS-MODEL预测蛋白三级结构，利用STRING构建蛋白互作网络，预测与其发生相互作用的蛋白；
使用 MEGA 5.0 软件采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建氨基酸系统进化树。

1.2.4 山羊组织表达差异分析 根据克隆获得的序列设计其RT-qPCR引物（表2）。利用RT-qPCR技术检测在各个组织中的表达差异，以山羊心脏组织的Ct值为对照，以为内参基因[28-29]矫正目的基因的相对表达水平，每个组织样本设置3个重复。

1.2.5 山羊肌内脂肪细胞培养 利用实验室前期分离冻存于10% DMSO冷冻液中[30]的两日龄山羊肌内前体脂肪细胞，于37℃融化复苏，培养于含有 10%胎牛血清DMEM 完全培养液中。细胞培养到约80%汇合，细胞出现接触抑制后，接种于6孔板，继续培养，直到细胞用于试验操作。

1.2.6 山羊亚克隆及过表达载体构建 根据1.2.2克隆获得的山羊CDS 区序列，在引物上游加上保护碱基、d Ⅲ 酶切位点、Kozak序列和Flag标签蛋白序列；
下游加上H Ⅰ 酶切位点，引物序列见表1。将试验获得的pMD19-T-质粒作为模板，利用以上引物进行扩增。对PCR目的产物切胶回收后，进行酶切，于16℃连接至真核表达载体pcDNA3.1上。转化至感受态细胞DH5α，经菌液PCR鉴定后，提取质粒进行双酶切鉴定，然后送至成都擎科生物有限公司进行测序鉴定，鉴定成功即可获得过表达载体pcDNA3.1-。

1.2.7 干扰siRNA合成 以克隆获得的CDS区序列为模板，由上海吉玛制药技术有限公司合成3条山羊siRNA，序列信息见表3。

1.2.8 细胞转染 过表达载体或siRNA转染至覆盖皿底达80%的F3代山羊肌内前体脂肪细胞，完全培养液在转染的4h之前弃掉，加入Opti-MEM进行细胞饥饿处理4h后，在6孔板中每孔分别加入1 μg重组载体或2 μL siRNA，混匀后置于37℃、5% CO2培养箱，6 h后弃掉转染液，PBS清洗3遍，每孔加入2.5 mL油酸（50 μmol·L-1）诱导液进行诱导分化。

1.2.9 油红O染色检测FATP1对脂滴生成的影响 利用油红O染色法观察过表达或干扰后山羊肌内脂肪细胞分化过程中脂滴积聚的变化。用于染色的肌内脂肪细胞接种于6孔板，转染2 d后弃去培养基，用PBS缓慢清洗3次，甲醛固定30 min，弃去甲醛，PBS清洗3次后加入适量过滤后的油红O工作液，染色20 min，弃去油红O工作液后用PBS清洗多次，显微镜下观察并拍照。

1.2.10 甘油三酯测定 用PBS清洗待测的细胞2—3遍，每孔加入200 mL裂解液，吹打收集细胞于离心管中，混匀后室温静置10 min。取适量上清液70℃加热10 min，室温2 000 r/min离心5 min，上清液即可用于甘油三酯测定。按R1﹕R2=4﹕1的比例配制工作液，96孔板每孔加入10 μL待测样品和190 μL工作液，同时稀释甘油标准品，将4 mmol·L-1的甘油标准品用蒸馏水按比例稀释为1 000、500、125、31.25、7.8125、0 μmol·L-1，每个样品设置3个重复，37℃或者25℃反应15 min，550 nm波长测定OD值，绘制标准曲线并计算各样品甘油三酯浓度。

剩余裂解液采用BCA法进行蛋白定量。按试剂A﹕试剂B=50﹕1配制BCA工作液，并充分混匀。将浓度为2 mg·mL-1的BSA标准品按比例稀释为2 000、1 500、750、250、25、0 μg·mL-1各取25 μL标准品和待测样品加入96孔板中，每孔加入200 μLBCA工作液，每个样品设置3个重复，振荡30 s充分混匀，37℃孵育30 min。冷却到室温后，在酶标仪上的562 nm波长检测吸光值，绘制蛋白标曲并计算各样品蛋白浓度。利用计算所得的各样品蛋白浓度来对各样品甘油三酯浓度进行校准。

1.2.11 实时荧光定量PCR（RT-qPCR） 为进一步探究FATP1在脂质代谢中的作用机制，将其过表达及干扰后，检测对脂肪酸延长相关基因（，，，，和）、脂肪酸转运相关基因（，和）、甘油三酯合成相关基因（，，，和）和脂肪分解相关基因（，，，和）表达的影响。引物序列见表2。

表2 定量引物

S：正义链引物；
A：反义链引物；
：泛表达转录子基因 S: Sense primer; A: Antisense primer;: Ubiquitously expressed transcript

表3 siRNA序列

1.2.12 数据分析 RT-qPCR结果用2−△△Ct法进行统计分析，采用SPSS软件单因素方差分析法进行差异显著性分析，选择LSD方法和邓肯法进行事后比较，＜0.05时为差异显著，＜0.01时为差异极显著，所有试验数据设置至少3个重复，利用GraphPad Prism 5进行统计分析作图。

2.1 山羊FATP1克隆

将反转录的山羊各组织cDNA混合后作为模板，RT-PCR扩增获得山羊序列2 07 8bp（图1），其中5′UTR 112 bp，CDS区1 941 bp，3′UTR 25 bp，编码646个氨基酸残基。

图1 山羊FATP1 PCR扩增

2.2 山羊FATP1生物学特性分析

2.2.1 蛋白理化性质分析 对山羊FATP1蛋白序列进行分析，预测其蛋白分子式为C3196H5026N884O898S25，分子质量为71 003.95 Da；
理论等电点（Theoretical pI）为8.83，不稳定指数为34.85，亲水性总平均值为0.044，推测该蛋白为碱性疏水稳定蛋白。该氨基酸组成中，亮氨酸（Leu）是占比最多的氨基酸残基（12.2%），其次为甘氨酸（Gly）（10.4%）（图2）。TargetP-2.0 预测FATP1信号肽可能性为0.9552。

A：FATP1蛋白亲疏水性预测。B：FATP1蛋白跨膜结构预测。C：FATP1蛋白信号肽预测

2.2.2 蛋白质结构预测 山羊FATP1二级结构预测显示，227（35.14%）个氨基酸残基可能形成 α-螺旋（h），146（22.60%）个氨基酸残基可能形成β-折叠(e)，219（33.90%）个氨基酸残基可能形成无规则卷曲（c），54（8.36%）个氨基酸残基可能形成β-转角（t）（图3-A）。三级结构预测显示，山羊与绵羊的FATP1蛋白质三级结构相似，而与牛的FATP1蛋白质三级结构略有不同（图4）。采用 STRING 交互式数据库搜索可能与FATP1蛋白各成员相互作用的蛋白，结果如图3-B。

2.2.3 氨基酸序列同源性比对及系统进化树构建 利用NCBI对不同物种FATP1的氨基酸同源性进行比较，发现山羊与绵羊的氨基酸序列同源性最高（99.38%），其次为牛（98.45%）和猪（93.96%），而与人的同源性为92.26%。利用MAGE 5.0构建山羊FATP1氨基酸序列系统进化树，结果如图所示（图3-C）。

A：FATP1蛋白质二级结构预测（蓝色线条为α-螺旋，红色线条为β-折叠，紫色线条为无规则卷曲，绿色线条为β-转角）；
B：FATP1相互作用蛋白预测；
C：FATP1氨基酸序列系统进化树

A：山羊FATP1蛋白三级结构；
B：绵羊FATP1蛋白三级结构；
C：牛FATP1蛋白三级结构

2.3 山羊FATP1基因组织表达差异分析

以山羊心脏组织为对照，为内参基因，分析RT-qPCR定量结果可知在山羊各组织中均有表达，其中在山羊小肠组织中高表达（＜0.01，图5-A）。

2.4 过表达载体构建成功及siRNA干扰效率检测

使用d Ⅲ和H Ⅰ限制性内切酶对pcDNA3.1-重组质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别得到长度约为5 428 bp的pcDNA3.1载体片段和2 040 bp 的目的基因片段（图5-B），测序结果显示，插入序列与目的基因序列完全一致，证明表达载体pcDNA3.1-构建成功。采用qPCR技术检测FATP1过表达及siRNA干扰后FATP1的表达情况，以UXT作为内参基因，阴性对照组表达水平作为参照，结果显示，转染了pcDNA3.1-后FATP1的表达水平提高了约230倍（图5-C），合成的siRNA对FATP1的表达水平均有干扰效果，其中FATP1-1的干扰效果最佳，达到约74%（图5-D），故后续干扰试验采用FATP1-1。

2.5 过表达FATP1促进肌内脂肪细胞脂质沉积

FATP1过表达后能够显著增加山羊肌内前体脂肪细胞脂滴的形成（图6-A—C）（＜0.01）和甘油三酯沉积（图6-D）（＜0.01）。同时FATP1表达水平的增加还能够显著提高甘油三酯合成相关基因（＜0.01）、（＜0.01）和（＜0.01）（图6-E），脂肪酸去饱和及延长相关基因（＜0.01）、（＜0.01）和（＜0.05）（图6-F），以及脂肪酸转运相关基因（＜0.01）（图6-H）的表达量，而显著降低脂解相关基因（＜0.01）的表达（图6-G）。推测，FATP1能够通过促进甘油三酯的合成及脂质的延长和转运，抑制脂质分解，从而促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质的沉积。

A：重组质粒 pcDNA3.1-FATP1酶切鉴定（泳道1为Marker DL5000，泳道2为pcDNA3.1，泳道3为重组质粒pcDNA3.1-FATP1，泳道4为Marker Ⅲ）。

B：山羊FATP1在不同组织中的表达水平（差异显著（P＜0.05）用不同小写字母表示；
差异极显著（P＜0.01）用不同大写字母表示；
差异不显著（P>0.05）用相同字母表示）。C：FATP1在细胞中的过表达效率。D：FATP1在细胞中的干扰效率（*表示在0.05 水平上显著， **表示在0.01水平显著，***表示在0.001水平上显著）

A和B：对照组（pcDNA3.1）及过表达组（FATP1 OVER）细胞油红O染色；
C：油红O染色OD值检测（490nm）；
D：细胞甘油三酯含量测定；
E：甘油三酯合成相关基因检测；
F：脂肪酸去饱和及延长相关基因检测；
G：脂肪酸降解相关基因检测；
H：脂肪酸转运相关基因检测

2.6 干扰FATP1基因抑制肌内脂肪细胞脂质积累

FATP1干扰后显著减少了山羊肌内前体脂肪细胞中脂滴的形成（图7-A—C）（＜0.01）和甘油三酯的生成（图7-D）（＜0.01）。同时FATP1表达水平的降低也显著地减少了脂肪酸去饱和及延长相关基因（＜0.01）和（＜0.05）（图7-E），脂肪酸转运相关基因（＜0.01）（图7-F）的表达量，甘油三酯合成相关基因GPAM（=0.069）和DGAT2（=0.065）的表达量也有所下降，但其变化不显著（图7-G），而脂肪分解相关基因（＜0.01）和（＜0.05）的表达水平显著升高（图7-H）。推测，干扰FATP1能够通过抑制脂肪酸的延长和转运，增加脂质降解来抑制山羊脂肪细胞中脂质的沉积。

A和B：对照组（si-NC）及干扰组（FATP1-1）细胞油红O染色；
C：油红O染色OD值检测（490nm）；
D：细胞甘油三酯含量测定；
E：脂肪酸去饱和及延长相关基因检测；
F：脂肪酸转运相关基因检测；
G：甘油三酯合成相关基因检测；
H：脂肪酸降解相关基因检测

3.1 FATP1促进山羊肌内脂肪细胞脂质沉积

FATP1首次在3T3-L1脂肪细胞中被鉴定为定位于质膜的完整膜蛋白[10]，其质膜定位后续在293细胞[31]和棕色脂肪组织[32]中也被鉴定到。FATP1通过其膜定位参与FAs转运，进而调控甘油三酯合成和脂质沉积[14,33]。过表达FATP1可提高FAs的转运率，增加FAs的摄取，抑制FAs的氧化，最终促进酵母菌株[34]、293细胞[31]、人肌肉细胞[26]和猪肌内前体脂肪细胞的脂质积累[14]。而降低FATP1的表达则能够引起3T3-L1脂肪细胞甘油三酯积累减少和脂滴减小[35]。在本研究中，干扰山羊脂肪细胞FATP1后，虽然对甘油三酯合成的相关基因的表达水平没有显著影响，但是脂质降解基因表达水平显著升高，细胞中甘油三酯含量和脂滴的数量都有所减少。而在过表达FATP1后，细胞内脂质含量及促进脂质合成基因的表达水平都有所提高。推测，FATP1可能通过促进脂质沉积相关基因的合成和抑制脂解相关基因的表达，从而促进山羊肌内脂肪细胞脂质沉积。

3.2 FATP1功能具有两面性

然而，随着研究的不断深入，对FATP1的功能也开始逐渐有了争议。虽然有许多研究表明FATP1可促进脂质积累，但也有研究者得到了相反的结果[11,36]。脂肪组织是一个典型的脂质储存库，FATP1能够增强其脂质的积累。相反，肌肉收缩需要持续消耗能量，FATP1则促进FAs氧化以提供能量。在大鼠L6E6肌管[37]、心肌细胞[38-39]和肌肉组织[11]中，FATP1主要定位于线粒体，从而介导了这些组织中FAs的氧化[40]。在肌肉组织中FATP1的线粒体定位与FATP1的FAs氧化作用相关。在培养的肌肉细胞和小鼠肌肉组织中，FATP1过表达则以促进脂肪酸氧化而非甘油三酯积累为目标[11,41]。FATP1功能的两面性可能与其不同的组织及亚细胞定位相关。

3.3 FATP1是重要的脂质代谢调控因子

FATP1对脂质代谢的影响受PPAR[42-43]、TR4[44]、 KLF15[45-47]等转录因子的调节。TR4可直接结合位于FATP1 5′启动子区域的TR4响应元件来反式激活FATP1 5′启动子活性，从而诱导FATP1基因的表达，促进3T3-L1脂肪细胞中的脂质积累[44]。此外，脂滴相关基因也会影响FATP1对脂代谢的调控。脂滴是中性脂质储存和动员的关键位点[48]。FATP1能与DGAT2形成甘油三酯合成复合物[49]，作用于ER–LD界面，作用促进哺乳动物细胞中脂滴的扩增，从而影响机体脂代谢。本试验中通过过表达和干扰试验来探究在调控山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积中的作用，这也为后续从转录因子等上游调节因子的角度完善胞内脂质代谢的调控网络奠定了基础。FATP1在脂肪和肌肉组织中都能够起到调节脂质代谢的作用，由此可见FATP1在机体脂代谢中的重要性。无论是FATP1完整的调控网络的挖掘还是其既能促进脂质积累也和脂肪酸氧化相关的独特性功能，都需要更进一步的研究来阐明，从而更充分地把握该基因的作用机制，并将其对脂质代谢的调控作用运用到山羊及更多家畜的优良品种选育中。

克隆获得山羊的CDS区全长1 941 bp，编码646个氨基酸残基，在山羊小肠组织中高表达。FATP1可能通过促进脂质生成、抑制脂质分解和脂肪酸氧化，进而促进山羊肌内脂肪细胞脂质沉积。这些结果能为进一步揭示在脂质代谢中的作用及其调控机制提供理论基础。

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Role of

LI Qi1, YANG ChangHeng1, WANG Yong1, LIN YaQiu1, 2, XIANG Hua2, ZHU Jiangjiang1, 2

1Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic ResourceReservation and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province/Southwest Minzu University, Chengdu 610041;2Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education/Southwest Minzu University, Chengdu 610041

【Background】Fatty acid transporter 1 (FATP1) can promote the uptake of fatty acids in mammals. This process is very important to maintain the balance of lipid metabolism, and also has an important impact on the meat quality of livestock.【Objective】The aim of this study was to obtain the CDS sequence of goatgene, to detect the expression ofgene in different tissues of goats, and to explore its effect on lipid metabolism of goat intramuscular adipocytes, so as to provide a reference for further revealing the mechanism ofgene in goat lipid metabolism, which can provide a theoretical basis for genetic and breeding improvement of goats.【Method】The CDS of goatgene was cloned by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR), its biological characteristics, such as hydrophobicity, transmembrane region and signal peptide, were analyzed by online tools, and its amino acid sequence phylogenetic tree was constructed. The expression level ofgene in different goat tissues was detected by RT-qPCR and its tissue expression pattern was constructed. The constructed eukaryotic expression vector and screened siRNA were used to overexpress and interfere with FATP1 in goat intramuscular adipocytes, the effects ofgene overexpression and interference on lipid deposition in goat intramuscular adipocytes were detected by oil red O staining and triglyceride determination, and the effects ofgene overexpression and interference on the expression of genes related to lipid metabolism were further explored by RT-qPCR. 【Result】The CDS ofgene was 1 941 bp, encoding 646 amino acids residues. It was predicted that its molecular formula was C3196H5026N884O898S25, and the protein was a basic hydrophobic stable protein. Phylogenetic tree analysis of amino acid sequence showed that goat FATP1 was closely related to sheep. RT-qPCR showed that the expression ofgene was the highest in goat small intestine. Oil red O staining and triglyceride determination showed that the number of lipid droplets and triglyceride content in goat intramuscular adipocytes increased after overexpression of FATP1, but the opposite results were obtained after interference with FATP1. After overexpression of FATP1 in goat adipocytes, the expression levels of fatty acid synthesis, transport and other related genes(＜0.01),(＜0.01),(＜0.01),(＜0.01),(＜0.01),(＜0.01) and(＜0.05) increased significantly, while the expression level of lipolysis related genes(＜0.01) decreased significantly. After interfering FATP1, the expression of fatty acid transport, elongation and other related genes(＜0.01),(＜0.01) and(＜0.05) decreased significantly, and the expression of lipolysis related genes(＜0.01) and(＜0.05) increased significantly. 【Conclusion】FATP1 might significantly promote the lipid deposition of goat intramuscular precursor adipocytes by promoting the expression of genes related to cell lipid production and reducing the expression of genes related to lipolysis, which provided an experimental reference for further revealing the role and molecular mechanism of FATP1 gene in regulating lipid metabolism.

goat; FATP1; intramuscular adipocytes; lipid deposition

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.015

2021-12-02；

2022-10-31

国家自然科学基金（32072723）、国家重点研发计划（2016YFC0500709）、四川省科技计划项目（2020JDJQ0010，2021YFYZ0003）、中央高校基本科研业务费专项基金（2021PTJS21）

李琪，E-mail：liqiligexiao@outlook.com。通信作者 朱江江，E-mail：zhujiang4656@hotmail.com。通信作者向华，E-mail：xianghua2008411@163.com

（责任编辑 林鉴非）

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